體外敲降轉(zhuǎn)錄因子BCL11A對(duì)胚胎神經(jīng)元特異性因子的影響

許 貞，李淑蓉，蘇炳銀△，解學(xué)敏△

1.成都醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)；2.發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 病理與病理生理學(xué)教研室(成都 610500)

智力障礙(intellectual disability, ID)是一類具有廣泛遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在遺傳因素引起的智力障礙中，其中2號(hào)染色體p15至p16.1片段缺失型智力障礙是一類特異的ID亞型。BCL11A(B-Cell CLL/Lymphoma 11A，BCL11A/Ctip1)是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其基因位于人類染色體2p16.1。在大腦皮層發(fā)育過程中，BCL11A對(duì)深層皮質(zhì)中的投射神經(jīng)元亞型形成發(fā)揮重要作用，與皮層發(fā)育的關(guān)鍵因子TBR1共定位在皮質(zhì)層的第5層，抑制TBR1的表達(dá)可調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育過程中的重要基因網(wǎng)絡(luò)[1-2]。BCL11A在胚胎發(fā)育過程中對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的調(diào)控作用鮮有研究。本研究旨在探討B(tài)CL11A對(duì)胚胎神經(jīng)元特異轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制，為BCL11A缺失所致2p15-16.1缺失型智力障礙的發(fā)生機(jī)制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及胎鼠

293T細(xì)胞系(人腎上皮細(xì)胞系)來源于人胚腎細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞系(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系)來源于人神經(jīng)母細(xì)胞。野生型C57/BL6小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。將野生型雄性及雌性成熟小鼠飼養(yǎng)于同一籠中進(jìn)行配種，檢栓并計(jì)算孕齡，獲取胚胎11.5、13.5、15.5、18.5 d胎腦組織及出生后7 d小鼠大腦。

1.2 試劑及主要設(shè)備

免疫印跡技術(shù)(Western blot)全套試劑、RIPA、蛋白酶抑制劑(PMSF)購(gòu)自上海碧云天公司，TRIZOL Reagent購(gòu)自美國(guó)英杰生物有限公司，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，anti-Ctip1 antibody、anti-β-actin antibody購(gòu)自上海艾博抗公司。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，電泳及凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀及CFX96Tm Real-time system購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，冰凍切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 RT-qPCR 檢測(cè)目的基因表達(dá)

利用Trizol提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨髓、大腦皮層，胚胎13.5、18.5 d胎腦組織及出生后7 d小鼠大腦，轉(zhuǎn)染siRNAs 48 h的293T細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞的總RNA。利用TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒得到cDNA，參照試劑盒說明書步驟操作。以cDNA為模版應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。設(shè)計(jì)相關(guān)引物序列見下表(表1)。

表1 相關(guān)的引物序列

1.4 Western blot檢測(cè)BCL11A蛋白表達(dá)

提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨髓、大腦皮層及胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d胎腦組織蛋白，配置濃度10% SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，電泳電壓60～120 V。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將攜有蛋白的PVDF膜浸于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。1∶2 000(anti-Ctip1、anti-β-actin)稀釋一抗，4 ℃搖床孵育過夜。次日選取對(duì)應(yīng)二抗進(jìn)行室溫孵育； TBS-T將膜浸洗3次后加入顯色液，置于Bio-Rad成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，使用Image LabTM及Image J軟件進(jìn)行分析。

1.5 免疫熒光檢測(cè)胚胎13.5 d BCL11A組織分布

PBS浸泡胚胎13.5 d小鼠大腦皮層冰凍切片(-20 ℃保存)至室溫。 4%PFA(多聚甲醛)室溫固定10 min。PBS漂洗3次后以Tritonx-100(0.5%)滴于組織區(qū)域，10～20 min后用PBS漂洗3次。進(jìn)口胎牛血清滴加于組織區(qū)域，室溫封閉30 min。稀釋并滴加一抗(anti-Ctip1 antibody，1∶200稀釋)，4 ℃冰箱濕孵過夜。次日，PBS漂洗并孵育二抗：每組織區(qū)域滴加20 μL二抗(1∶400稀釋)，避光室溫孵育2 h后避光漂洗，滴加10 μL含DAPI的封片劑于組織區(qū)域，封片。利用正置熒光顯微鏡觀察，并使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y培養(yǎng)于含1%雙抗、10%FBS(胎牛血清)、DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度為80%～90%或2～3 d后傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作前1 d，將SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度以細(xì)胞密度達(dá)70%～80%為宜。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照TransIntroTMEL Transfection Reagent說明書操作。在24 孔板中培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)70%；轉(zhuǎn)染前4 h更換無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合體：用Opti-MEM稀釋siRNA干擾試劑，混勻；用Opti-MEM稀釋TransIntroTMEL Transfection Reagent，混勻；分別室溫放置5 min 后，混合步驟a和b兩個(gè)體系。輕輕混勻后室溫放置20 min。在24孔板中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合體，輕輕混勻。 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4～6 h后可換含血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)在上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。

1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀分析神經(jīng)元特異性因子的啟動(dòng)子活性

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中，加入甲醛(終濃度1%)固定，加入甘氨酸終止反應(yīng)，PBS清洗后，離心收集固定好的細(xì)胞，重懸細(xì)胞放冰上15 min，用PBS漂洗，用核制備緩沖液Ⅰ、Ⅱ重懸細(xì)胞，在冰上靜置10 min，中途渦旋震蕩兩次，離心后加入裂解液后劇烈渦旋，冰上靜置30 min。用超聲波破碎儀使染色質(zhì)碎裂。加入超聲裂解液、RNase A，37 ℃恒溫箱靜置2 h，加入5 mol/L NaCl 4 μL、20 μg蛋白酶K。第2天用配好的有機(jī)溶液(酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1)抽提DNA，取樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。蛋白提取物中加Invitrogen?Protein A /Protein G Dynabeads，加入H3K4me3、H3K27me3抗體和BSA，再分別加入特異抗體和同種屬IgG，搖床上低溫過夜。在Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads中加入IP細(xì)胞裂解液和BSA,4 ℃冰箱孵育12 h。離心去掉上清。加入Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads, 低溫?fù)u床處理2～3 h。低溫離心后棄上清，在沉淀中加入現(xiàn)配置的ChIP提取液，搖床上放置30 min，離心轉(zhuǎn)移到新的離心管。ChIP提取液和輸入樣品中，加入RNase A，37 ℃ 恒溫箱放置2 h。再加入NaCl與蛋白酶K混勻，65 ℃水浴裂解過夜。第2天抽提并純化DNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后進(jìn)行qPCR定量分析。空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)表達(dá)水平以2-ΔΔCT值計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BCL11A在成年小鼠各器官組織及不同時(shí)期胎鼠大腦組織中的表達(dá)

結(jié)合課題組前期針對(duì)ENCODE來源基因芯片和GTEx數(shù)據(jù)進(jìn)行了人源BCL11A表達(dá)譜分析，為進(jìn)一步探索BCL11A在小鼠各器官組織中的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠腦組織及成鼠各主要器官組織中的表達(dá)量。qPCR結(jié)果顯示BCL11A主要表達(dá)于胚胎13.5 d的胎鼠大腦、成年小鼠的骨髓、大腦皮層、脾臟、肺組織中，此結(jié)果與課題組前期所分析BCL11A在人類各器官組織表達(dá)譜相符(圖1)。

為探索BCL11A在小鼠胎腦發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)選取胚胎13.5 d、胚胎18.5 d、出生7 d的小鼠大腦及成年小鼠大腦皮層進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示小鼠胚胎發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期胚胎13.5 d的胚腦中BCL11A表達(dá)量最高，胚胎18.5 d時(shí)表達(dá)相對(duì)下降，而出生后7 d和成年小鼠的大腦皮層，BCL11A表達(dá)量較胚胎發(fā)育時(shí)期明顯降低，提示BCL11A在胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期具有重要調(diào)控作用(圖2)。

2.2 Western blot檢測(cè)小鼠各器官組織及早期發(fā)育階段中BCL11A的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明BCL11A在成年小鼠的大腦皮層、脾臟、肺中均有表達(dá)，且脾臟和大腦皮層的表達(dá)量較高，而在心臟、肝、腎臟、肌肉及骨髓中未表達(dá)，其蛋白水平與qPCR的結(jié)果相吻合。胚胎發(fā)育階段4個(gè)關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d中，BCL11A蛋白水平在胚胎13.5 d的胚腦達(dá)到最高，進(jìn)一步提示在皮層神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期胚胎13.5 d，BCL11A參與調(diào)控重要的神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)事件(圖3、4)。

2.3 在293T細(xì)胞中驗(yàn)證siRNA的干擾效率

針對(duì)人源BCL11A的mRNA序列設(shè)計(jì)3組siRNA，并在人胚腎上皮293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA418、siRNA914、siRNA1132，收集細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR檢測(cè)BCL11A基因mRNA的表達(dá)變化。與對(duì)照組siGFP相比，轉(zhuǎn)入siRNA418、siRNA914及siRNA1132的細(xì)胞中BCL11A 的mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.001)，siRNA418中相對(duì)對(duì)照組，BCL11A表達(dá)量為(27.64±2.58)%，siRNA914中BCL11A基因RNA的表達(dá)量相對(duì)siGFP組為(49.32±4.12)%，siRNA1132中BCL11A基因RNA的表達(dá)量相對(duì)siGFP降至(21.28±1.23)%，3組siRNA均能有效降低目的細(xì)胞中BCL11A的mRNA水平(圖5)。

2.4 BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠大腦皮層的表達(dá)

為進(jìn)一步明確BCL11A在小鼠大腦的亞定位，選取其蛋白表達(dá)水平最高的時(shí)期，即胚胎13.5 d。取該時(shí)期小鼠胎腦進(jìn)行BCL11A的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)標(biāo)記神經(jīng)元特異性因子NeuN。免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BCL11A在小鼠胚胎神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期胚胎13.5 d呈現(xiàn)陽性表達(dá)，并主要分布于該時(shí)期胚腦皮層區(qū)域，并與神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN具有相似表達(dá)與分布特性(圖6)。

2.5 siRNA干擾BCL11A的表達(dá)導(dǎo)致關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下降

將干擾效率最優(yōu)的兩組siRNA(siRNA418和siRNA1132)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞48 h后，檢測(cè)神經(jīng)元特異轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)BCL11A的表達(dá)降低致使皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育關(guān)鍵基因Sox6、Tbr2、NeuroD2表達(dá)量明顯下降，提示BCL11A對(duì)于皮質(zhì)神經(jīng)元關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有正向調(diào)控作用(圖7)。

2.6 SH-SY5Y中BCL11A敲降后重要轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子染色質(zhì)活性改變

利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)初步考察BCL11A受干擾情況下，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中皮層發(fā)育關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子染色質(zhì)活性變化。結(jié)果表明，在SH-SY5Y細(xì)胞中敲降BCL11A的表達(dá)，神經(jīng)元前體細(xì)胞關(guān)鍵因子Sox6、Tbr2神經(jīng)元關(guān)鍵因子NeuroD2的啟動(dòng)子區(qū)域活性染色質(zhì)修飾H3K4me3富集程度明顯降低。啟動(dòng)子抑制性染色質(zhì)修飾H3K27me3富集程度明顯增加。與此同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵基因GFAP、BLBP啟動(dòng)子位點(diǎn)的染色質(zhì)修飾無明顯變化(圖8～9)。

3 討論

BCL11A在大腦皮層投射神經(jīng)元的發(fā)育過程中至關(guān)重要。BCL11A/Ctip1通過調(diào)節(jié)深層投射神經(jīng)元亞型的特異性來精確控制新皮層的發(fā)育[3]。研究[4]證實(shí)了僅BCL11A基因的單倍體劑量不足就足以引起神經(jīng)發(fā)育缺陷，BCL11A的突變會(huì)導(dǎo)致獨(dú)特的ID綜合征。目前已報(bào)道的2p15-16.1缺失型智力障礙的15個(gè)病例是由于其基因組2p15-16.1不同類型片段缺失而出現(xiàn)不同程度的智力發(fā)育延緩，畸形特征及微顱畸形特征[5-6]。深度解讀發(fā)育障礙研究計(jì)劃也揭示位于部分智力障礙患者中的 BCL11A 位點(diǎn)的錯(cuò)意突變(MIM: 606557)與智力障礙的發(fā)生高度關(guān)聯(lián)[7-9]。

BCL11A作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)具有重要功能，在淋巴系統(tǒng)的發(fā)育、血液胎兒型珠蛋白正常表達(dá)亦具有重要的調(diào)控作用。BCL11A能夠在紅系祖細(xì)胞內(nèi)募集重要的轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)控下游紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控紅細(xì)胞的正常分化與形成[10]。

本課題通過qRT-PCR和Western blot方法發(fā)現(xiàn)并經(jīng)免疫熒光證實(shí)BCL11A主要表達(dá)在小鼠胚胎13.5 d的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元。結(jié)合BCL11A在人類及小鼠的表達(dá)譜及胚胎發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期胚胎13.5 d BCL11A的陽性表達(dá)，可以推論BCL11A在胚胎皮層發(fā)育時(shí)期發(fā)揮了重要作用。為初步探究其調(diào)控機(jī)制，課題組通過ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞中BCL11A表達(dá)降低的情況下，神經(jīng)元前體細(xì)胞關(guān)鍵基因Sox6、Tbr2神經(jīng)元關(guān)鍵基因NeuroD2的啟動(dòng)子活性染色質(zhì)修飾H3K4me3和抑制性染色質(zhì)修飾H3K27me3富集程度出現(xiàn)了明顯改變。

既往研究[11]表明Sox6是非膽堿能皮層投射神經(jīng)元的重要分類標(biāo)記；Tbr2作為中間祖細(xì)胞標(biāo)志物，可以增強(qiáng)小鼠皮質(zhì)的神經(jīng)發(fā)生，調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)元的精細(xì)尺度空間和電路組織。NeuroD2有助于皮質(zhì)細(xì)胞遷移的最終定位；結(jié)合ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果在BCL11A敲降的情況下，這3種大腦皮質(zhì)形成的關(guān)鍵基因表達(dá)均明顯下降，這表明在皮質(zhì)形成的過程中BCL11A可能對(duì)這3種基因起到了正向調(diào)節(jié)作用，結(jié)合BCL11A在皮層發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用，可以推論BCL11A和其他神經(jīng)元關(guān)鍵因子一起參加到皮質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，并與智力發(fā)育有著密切聯(lián)系。而相關(guān)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，BCL11A對(duì)于胚胎神經(jīng)元發(fā)育的具體功能及作為轉(zhuǎn)錄因子參與皮層發(fā)育的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。完善BCL11A在皮層發(fā)育中的相關(guān)研究對(duì)于研究和診治智力障礙至關(guān)重要。