地黃飲子HPLC指紋圖譜研究

郭司群 遲曉雪

【摘 要】 目的：建立地黃飲子的高效液相色譜指紋圖譜，對其成分進行分析。方法：利用HPLC-DAD方法，梯度洗脫，測定10批自制地黃飲子的指紋圖譜，確定其共有峰并進行認定。結果：10批自制地黃飲子得到的色譜指紋圖譜有18個共有峰，通過與對照品的保留時間及紫外光譜的比對，確定5號峰為馬錢苷。結論：地黃飲子的高效液相紫外指紋圖譜特征性、專屬性強，可結合含量測定用于全面控制中藥制劑地黃飲子的質(zhì)量。

【關鍵詞】 地黃飲子;高效液相色譜;指紋圖譜

【中圖分類號】R284.1 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）10-0057-04

Abstract：Aim to establish the HPLC-DAD fingerprint of Rehmannia Drink and analyze its components. Methods： HPLC-DAD and gradient elution were used to determine the fingerprints of ten batches of self-made Rehmannia Drink. Result： There were 18 peaks in the chromatogram fingerprint obtained from ten batches of self-made Rehmannia Drink. By comparing with the retention time and UV spectrum of the control， the No.5 peak was identified as loganin. Conclusion： the HPLC-DAD fingerprint of Rehmannia Drink was characteristic and specific， which can be used to control the quality of Rehmannia Drink.

Keywords：Rehmannia Drink;HPLC-DAD;Fingerprint

地黃飲子出自《黃帝素問宣明論方》，主治瘖痱證，癥見舌強不能言，足廢不能用，口干不欲飲，苔黃膩，脈沉、細弱。地黃飲子是傳統(tǒng)的經(jīng)典方劑，該方臨床應用廣泛，多用于治療阿爾茨海默病、糖尿病、心血管疾病及中風等一系列疾病[1]，應用十分廣泛。地黃飲子由熟地黃、山茱萸、五味子、巴戟天、麥冬、薄荷、石菖蒲、石斛等15味藥材組成。目前地黃飲子主要集中在動物AD（阿爾茨海默?。┠Ｐ偷乃幮W研究[2]和血中移行成分研究的血清藥物化學方面[3]，而體外成分的質(zhì)量控制研究較少。由于復方制劑組方藥材較多成分復雜，其藥效不僅僅取決于某個成分，因此本實驗立足于對地黃飲子的指紋圖譜進行研究，找出共有成分，為其更加準確全面的進行質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Wasters600-996 高效液相色譜儀（二級管陣列檢測器）;TGL-16G-C高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）;H66MC型超聲震蕩儀（昆山市超聲儀器有限公司）;熟地黃、山茱萸、五味子、巴戟天、麥冬、薄荷、石菖蒲、石斛、遠志、附子、肉蓯蓉、茯苓、肉桂、大棗、姜（購于哈爾濱三棵樹藥材市場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學謝寧教授鑒定為正品）;自制10批地黃飲子（按生產(chǎn)日期編制批次）;乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國迪馬公司）;甲酸胺（分析純，天津科密歐試劑有限公司）;馬錢苷對照品（批號：111640-201707 ，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅡ2.0 mmid×75 mm（SHIMADZU）;流動相：采用乙腈（A）-0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺（B）體系，梯度洗脫程序為乙腈濃度梯度5.0%（0 min），5.0%～50%（0～10 min），50%～80%（10～15 min），80%～95%（15～17 min）。柱溫：30℃;流量：0.3 mL-1;檢測波長：254 nm;進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取馬錢苷對照品10 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度搖勻即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取地黃飲子組成15味藥材各15 g，混勻粉碎，粉末放于烘箱中烘至恒重，取地黃飲子粉末1 g或單味藥材粉末66 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度定容，浸泡20 min后超聲30 min，上清液3000 r ·min-1離心15 min，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3 精密度試驗 取同一批地黃飲子粉末，按2.2.2項下供試品制備方法制備樣品溶液，連續(xù)進樣5次，按2.1項下色譜條件測定。結果表明，共有峰的保留時間RSD（%）小于1%，峰面積的RSD（%）小于1%，符合指紋圖譜要求。

2.4 重復性試驗 取自制5批地黃飲子粉末，按2.2.2項下供試品制備方法制備樣品溶液，平行制備5份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，結果各共有峰峰面積的RSD（%）小于1%，保留時間的RSD小于1%，表明方法重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取上述地黃飲子粉末，按2.2.2項下供試品制備方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件分別在0、4、8、16、24 h進行測定。結果表明，各共有峰的保留時間和峰面積的RSD（%）均小于1%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 地黃飲子指紋圖譜的建立

取10批自制地黃飲子粉末，按2.2.2項下供試品制備方法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，采集指紋圖譜（見圖-1），以馬錢苷峰作為參照峰（S峰），共選取標定了18個共有峰（共有峰總面積占總峰面積的 70%以上）（見圖2）。計算各共有峰峰面積與參照峰峰面積的比值（相對峰面積），并使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）》，對10 批地黃飲子指紋圖譜進行相似度評價，設置樣品參照譜，采用平均數(shù)法生成對照指紋圖譜，手動多點校正，不同批次的相似度在0.889～0.979之間。見表1。

4 主要色譜峰的鑒定

按與樣品相同的色譜條件分析得到馬錢苷對照品的HPLC色譜圖。采用保留時間對照法，對樣品中5號成分進行定性分析，采用HPLC-DAD紫外檢測技術，將所得圖譜的形狀、吸收帶位置及相對強度與馬錢苷對照品紫外光譜圖進行比較。發(fā)現(xiàn)5號峰保留時間和紫外光譜圖均與馬錢苷相同（見圖3、圖4），所以確定5號成分為馬錢苷。

5 討論

本實驗考察有機相：甲醇、乙腈和水相：水、磷酸水、0.1%甲酸+10 mmoL·L-1甲酸胺體系，實驗結果表明乙腈-0.1%甲酸+10mmoL·L-1甲酸胺體系所得色譜圖中色譜峰較多且分離度較好，故選用此體系。采用二極管陣列檢測器，考察220 nm、240 nm、254 nm、280 nm、300 nm和330 nm處的圖譜特征，當波長為254 nm時，成分較多且基線平滑，最終確定波長為254 nm。

地黃飲子具有滋腎陰、補腎陽、開竅化痰的功效，多用于腦血栓、腦血管意外、中風、泛發(fā)性神經(jīng)皮炎、老年病等多種腦部疾病的治療。山茱萸具有補益肝腎的功效，與地黃飲子滋腎陰、補腎陽之功效相吻合。而馬錢苷屬環(huán)烯醚萜苷類，是山茱萸中的主要藥效成分之一，對神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用，對非特異性免疫功能也有增強作用，能促進巨噬細胞吞噬功能，延緩衰老[4]，這與地黃飲子用于腦部疾病的功用相吻合。對于其他17種共有成分同樣可依據(jù)上述的保留時間，紫外圖譜對照法，進行進一步的定性分析研究，從而為地黃飲子體外質(zhì)量控制研究提供更加全面的依據(jù)。參考文獻

[1]張喜武，劉美欣，謝寧，等.地黃飲子現(xiàn)代研究進展[J].中醫(yī)藥信息，2017，34（5）：124-128.

[2]于淼，謝寧，關慧波，等.地黃飲子對AD模型大鼠腦內(nèi)Aβ生成的干預機制[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016（6）：2281-2284.

[3]郭司群，朱魁元，謝寧，等.地黃飲子血清藥物化學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（8）：74-78.

[4]候家玉，方泰惠.中藥藥理學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社， 2007：253-255.

（收稿日期：2020-02-25 編輯：劉斌）