不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響

鞠雅晗，湯志敏，王宇瑤，代小嬋，羅 敏，谷 平

0引言

現(xiàn)代社會(huì)中，人們的工作和生活高度依賴于手機(jī)、電腦、電視等電子設(shè)備的使用，來(lái)源于這些電子設(shè)備顯示屏的光給人們的視覺健康帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[1]。藍(lán)光(400～500nm)廣泛存在于電子顯示屏的顯示光譜(400～800nm)之中，是其主要的短波光譜[2]。近年來(lái)，藍(lán)光的視覺安全問題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明，藍(lán)光對(duì)調(diào)節(jié)人體神經(jīng)內(nèi)分泌和晝夜節(jié)律有重要的影響[3]，然而，藍(lán)光對(duì)視覺系統(tǒng)安全性的影響也不容忽視。在眼內(nèi)，低于400nm的短波紫外線可大部分被角膜和晶狀體吸收，而藍(lán)光可穿透晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜，造成視網(wǎng)膜的損傷[4-5]。年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是中老年人致盲的首要疾病[6]，研究表明，慢性光損傷是ARMD發(fā)病的重要高危因素之一[7]，然而視網(wǎng)膜光損傷與ARMD發(fā)病之間的具體聯(lián)系尚不明確。視網(wǎng)膜是視覺系統(tǒng)的核心組織，而視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)是整個(gè)視網(wǎng)膜功能正常運(yùn)行的后勤保障細(xì)胞，RPE的功能障礙可隨后導(dǎo)致感光細(xì)胞的受損，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變[8-9]。因此，我們認(rèn)為，RPE的損傷是整個(gè)視網(wǎng)膜光損傷的核心和源頭環(huán)節(jié)，所以深入探討RPE的損傷及其機(jī)制是研究視網(wǎng)膜光損傷的最佳切入點(diǎn)。本研究通過(guò)模擬電子顯示屏的低光強(qiáng)藍(lán)光照射體外RPE細(xì)胞，評(píng)估和比較不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的活性、增殖能力、視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)及炎癥指標(biāo)水平的影響，為今后藍(lán)光損傷研究和干預(yù)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19細(xì)胞系)購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))，CCK-8(cell-counting kit-8)試劑(Dojindo，日本)，活/死細(xì)胞染色試劑盒(Invitrogen，美國(guó))，RNA提取試劑盒(EZ bioscience，中國(guó))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，Real-time PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國(guó))，酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，美國(guó))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，中國(guó))，超凈工作臺(tái)(BIO-HAZARD，VCM-420，中國(guó)臺(tái)灣)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞株，將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化及傳代，取狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組及藍(lán)光損傷模型建立將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和藍(lán)光組，其中對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)；藍(lán)光組細(xì)胞暴露于可發(fā)出3個(gè)不同波段藍(lán)光的有機(jī)發(fā)光二極管(OLED)顯示設(shè)備下，3個(gè)波段藍(lán)光的峰值波長(zhǎng)分別為447、456、468nm，藍(lán)光照度約為200Lx，光照距離為2cm，在細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)進(jìn)行藍(lán)光照射，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用隔光板避免不同波長(zhǎng)的藍(lán)光之間的干擾。處理完成后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取狀態(tài)良好的細(xì)胞消化并離心后，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)，藍(lán)光組細(xì)胞分別經(jīng)相應(yīng)波長(zhǎng)的藍(lán)光照射0、24、48、72h，處理結(jié)束后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，4h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)。細(xì)胞增殖活性=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.4活/死細(xì)胞染色檢測(cè)細(xì)胞活性取狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔4×104個(gè)細(xì)胞，將藍(lán)光組細(xì)胞置于447、456、468nm藍(lán)光下照射72h后，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書配置活/死細(xì)胞染色試劑培養(yǎng)基，以每孔覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)，孵育30min后，熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)，顯示綠色熒光的為活細(xì)胞，顯示紅色熒光的為死細(xì)胞。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)變化對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)，藍(lán)光組細(xì)胞置于447、456、468nm藍(lán)光下照射72h后，按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，利用Nanodrop2000c測(cè)定RNA濃度后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PubMed檢索的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由生工生物有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。Ki-67、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶(LRAT)、視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結(jié)合蛋白(IRBP) mRNA的相對(duì)表達(dá)量以GAPDH的表達(dá)為內(nèi)部參照，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算，以對(duì)照組表達(dá)量的倍數(shù)形式呈現(xiàn)。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，將各時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)根據(jù)各組細(xì)胞藍(lán)光照射0h測(cè)得的吸光度值進(jìn)行歸一化處理，與正常培養(yǎng)的對(duì)照組相比，光照24h后，各藍(lán)光組細(xì)胞的增殖活性略有減弱，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；光照48、72h后，藍(lán)光組各組細(xì)胞均有明顯的增殖活性抑制現(xiàn)象，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同波長(zhǎng)的藍(lán)光照射細(xì)胞不同時(shí)間(24、48、72h)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和增殖活性均受到不同程度的影響，其中波長(zhǎng)越短，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制越明顯，細(xì)胞生長(zhǎng)速率越緩慢(圖1A)。

增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)水平可間接反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力。Real-time PCR結(jié)果顯示，藍(lán)光照射細(xì)胞72h后，藍(lán)光組各組細(xì)胞Ki-67 mRNA表達(dá)水平均降低，與對(duì)照組相比，447nm藍(lán)光組細(xì)胞Ki-67 mRNA表達(dá)下降最明顯，其次為456nm藍(lán)光組、468nm藍(lán)光組(圖1B)。綜上結(jié)果，提示波長(zhǎng)越短的藍(lán)光對(duì)ARPE-19細(xì)胞的增殖活性影響越大。

圖1 不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

2.2不同波長(zhǎng)的藍(lán)光導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的變化顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，正常培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞融合度良好，細(xì)胞之間緊密連接(圖2A)，藍(lán)光組細(xì)胞在不同波長(zhǎng)的藍(lán)光照射72h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞融合不佳，細(xì)胞密度稀疏，其中447nm藍(lán)光組細(xì)胞形態(tài)變化最明顯(圖2B)，其次為456nm藍(lán)光組(圖2C)和468nm藍(lán)光組(圖2D)。

圖2 不同波長(zhǎng)藍(lán)光照射后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(×100)

2.3不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)細(xì)胞活性的影響活/死細(xì)胞染色

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，藍(lán)光組細(xì)胞在不同波長(zhǎng)藍(lán)光照射72h時(shí)后可引起細(xì)胞不同程度的死亡(圖3)。在447、456、468nm波段中，藍(lán)光的波長(zhǎng)越短，細(xì)胞的死亡數(shù)量越多，其中447nm藍(lán)光組細(xì)胞活性最差，提示短波長(zhǎng)藍(lán)光對(duì)ARPE-19細(xì)胞活性影響最大。

圖3 不同波長(zhǎng)的藍(lán)光照射對(duì)細(xì)胞活性的影響(×200)

2.4不同波長(zhǎng)藍(lán)光對(duì)細(xì)胞視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)的影響Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LRAT)、視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結(jié)合蛋白(IRBP) mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，藍(lán)光照射72h后，各視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)的基因表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中最短波長(zhǎng)447nm藍(lán)光照射后對(duì)細(xì)胞視循環(huán)功能指標(biāo)的抑制作用最顯著(圖4)，表明短波長(zhǎng)藍(lán)光對(duì)細(xì)胞的視循環(huán)功能影響最大。

圖4 不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)細(xì)胞視循環(huán)功能指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響

2.5不同波長(zhǎng)藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的變化Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，藍(lán)光照射72h后，ARPE-19細(xì)胞中MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，其中447nm波長(zhǎng)藍(lán)光照射后細(xì)胞中促炎因子上調(diào)最明顯(圖5)。

圖5 不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)細(xì)胞炎癥因子MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響

3討論

隨著電子技術(shù)的發(fā)展，人們的工作和生活中越來(lái)越離不開手機(jī)、電腦、電視等電子設(shè)備的使用，來(lái)自這些顯示設(shè)備中的光，尤其是其中的藍(lán)光對(duì)人類健康的影響已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。既往研究表明，藍(lán)光可以調(diào)節(jié)人的生物節(jié)律[10]。然而，藍(lán)光亦可損害我們的視覺系統(tǒng)。近年來(lái)，視網(wǎng)膜退行性疾病尤其是ARMD在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率正在逐年攀升[11]，這或許與人口老齡化的發(fā)展態(tài)勢(shì)有關(guān)，但也與人們對(duì)電子設(shè)備日益嚴(yán)重的依賴性有著不可分割的關(guān)系，增長(zhǎng)的屏幕使用時(shí)長(zhǎng)使視網(wǎng)膜暴露在更多的藍(lán)光之下，帶來(lái)潛在的視覺安全隱患。本研究使用模擬電子設(shè)備顯示屏照度的藍(lán)光進(jìn)行體外研究，可有效評(píng)估日常工作生活中顯示屏藍(lán)光對(duì)人類視覺安全的影響。

RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜中最重要的細(xì)胞之一，具有多種生理功能，如分泌、吞噬、屏障功能等，其負(fù)責(zé)保障視網(wǎng)膜正常功能的運(yùn)行[12]。RPE細(xì)胞的損傷或死亡通常被認(rèn)為是ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的核心環(huán)節(jié)[13]。本研究結(jié)果表明，藍(lán)光可造成RPE細(xì)胞的異常，包括形態(tài)改變，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞增殖能力減弱，甚至可造成細(xì)胞的死亡，且隨著藍(lán)光波長(zhǎng)的變短，其對(duì)RPE細(xì)胞的損傷作用越顯著。我們觀察到在短波長(zhǎng)藍(lán)光照射下，RPE細(xì)胞顯示出更為稀疏的細(xì)胞融合度，這也從側(cè)面體現(xiàn)了RPE細(xì)胞的增殖能力減弱，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)以及增殖標(biāo)志物Ki-67 mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果加以證實(shí)，隨著藍(lán)光波長(zhǎng)變短，藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的增殖抑制作用越強(qiáng)。此外，利用活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)清楚地看到不同波長(zhǎng)的藍(lán)光照射下RPE細(xì)胞的存活情況，藍(lán)光的照射波長(zhǎng)越短，RPE細(xì)胞中死細(xì)胞占總細(xì)胞的比例越大。

RPE的重要生理功能之一是視循環(huán)功能[14]，即視蛋白視黃醛的代謝，這是眼睛能感知到光的生理基礎(chǔ)。RPE細(xì)胞中表達(dá)多種關(guān)鍵的視循環(huán)功能基因，如RDH[15]、CRALBP[16]、LRAT[17]、IRBP[18]等，這些視循環(huán)功能蛋白均參與視黃醛代謝，負(fù)責(zé)其合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，RPE既是視黃醛的儲(chǔ)存場(chǎng)所又是其合成場(chǎng)所，因此，一旦這些關(guān)鍵的視循環(huán)蛋白發(fā)生異常，視黃醛的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝就無(wú)法完成，視覺功能將因此受到損害。本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光照射后，RPE細(xì)胞視循環(huán)功能指標(biāo)的基因表達(dá)水平明顯下降，意味著RPE細(xì)胞的視循環(huán)功能受損，其異?？赡軐?dǎo)致視覺障礙甚至失明。雖然ARMD病因仍然不明確，但是視黃醛代謝的障礙可能是其重要的誘導(dǎo)因素之一[19]。此外，RPE作為血-視網(wǎng)膜屏障的外部屏障起著重要的作用，因此RPE的功能障礙直接影響血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，而RPE功能受損后繼而將受到炎癥攻擊，導(dǎo)致RPE炎癥指標(biāo)的異常，從而誘導(dǎo)ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的進(jìn)展[20]。既往研究表明，RPE功能異常引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的關(guān)鍵誘發(fā)因素[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光可在體外誘導(dǎo)RPE細(xì)胞促炎因子MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，表明RPE的光損傷確實(shí)可造成其炎癥水平的異常。研究報(bào)道，促炎因子MCP-1等在視網(wǎng)膜退行性疾病(如ARMD)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[22]，提示光損傷后RPE異常的炎癥因子水平可能會(huì)導(dǎo)致ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)生。然而，本研究尚未對(duì)炎癥因子的異常表達(dá)機(jī)制進(jìn)行研究，將在今后的研究中進(jìn)行深入探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明藍(lán)光照射可引起RPE細(xì)胞的異常，包括細(xì)胞活性下降、細(xì)胞增殖能力減弱甚至細(xì)胞死亡。此外，藍(lán)光下調(diào)了RPE細(xì)胞視循環(huán)功能相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)可引起RPE細(xì)胞的炎癥指標(biāo)水平異常，表現(xiàn)為促炎因子IL-6和MCP-1的基因表達(dá)升高。與長(zhǎng)波長(zhǎng)藍(lán)光相比，短波長(zhǎng)藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的損傷作用更明顯。本研究旨在觀察不同波長(zhǎng)的藍(lán)光對(duì)維持視網(wǎng)膜功能的RPE細(xì)胞的損傷作用，探討對(duì)視覺系統(tǒng)損害的藍(lán)光波長(zhǎng)的特點(diǎn)，為視網(wǎng)膜的藍(lán)光損傷研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后顯示設(shè)備視覺安全性的發(fā)展給予了一定的指導(dǎo)意義。