基于過氧化物模擬酶的電化學(xué)傳感器的制備及其在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

徐生盼，戴子捷，張芝琳，江 凌，黃 和

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 淮安 223300；3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

過氧化氫(H2O2)是一種強(qiáng)氧化劑，在食品加工過程中廣泛被用作漂白劑和殺菌防腐劑。在此過程中產(chǎn)生大量含有H2O2的廢水，嚴(yán)重危害環(huán)境和人類健康。此外，一些食品加工行業(yè)在加工過程中可能會(huì)違規(guī)使用H2O2作漂白防腐劑，導(dǎo)致食品中的H2O2殘留超標(biāo)[1]。過量的H2O2進(jìn)入人體，會(huì)造成皮膚黏膜和細(xì)胞的大范圍損傷，并在代謝過程中產(chǎn)生大量的羥自由基，從而引起細(xì)胞凋亡與癌變，加快人體衰老甚至誘發(fā)心血管疾病[2-3]。隨著人們對(duì)食品安全問題的重視，實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的快速穩(wěn)定、高靈敏檢測(cè)具有重要的實(shí)際意義。

酶基生物傳感器由于結(jié)合了酶的高特異性和靈敏性，常被用來檢測(cè)H2O2，然而由于天然酶固有的局限性，比如儲(chǔ)存條件苛刻、容易變性失活、提取及使用成本高等缺點(diǎn)，促進(jìn)了科研工作者對(duì)“人工酶”的研究熱潮，合成了各種各樣可以模仿天然酶功能的納米材料[4-5]。在2013年Wei等[6]關(guān)于納米酶的全面綜述中，納米酶被定義為“具有類酶特性的納米材料”。至今為止，已有模擬氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)、水解酶以及多功能的納米酶的研究出現(xiàn)[6]，其中具有過氧化物酶活性的納米顆粒由于諸多優(yōu)異性能而受到廣泛關(guān)注和開發(fā)[7-8]。含有金屬離子的過氧化物模擬酶是最早發(fā)展起來的納米材料，迄今為止，科研工作者已發(fā)現(xiàn)諸如Fe3O4@ZnO納米顆粒[9]、Au/Co3O4-CeOx納米顆粒[10]、金屬硫化物[11-13]，金屬有機(jī)框架材料[14-17]等材料具有過氧化物模擬酶的催化活性。

水熱合成法是在一定溫度和壓力條件下，在水溶液中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的一種合成方法。采用該方法制備的納米材料具有操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物純度高、分散性好、粒度易控制等優(yōu)點(diǎn)，因而已被廣泛應(yīng)用于納米材料的制備[18-19]。本文中，筆者利用水熱合成法合成3種不同的過氧化物酶，比較3種酶的催化活性，將活性最好的FeCo納米復(fù)合材料修飾于金電極表面，制得用于檢測(cè)H2O2的電化學(xué)生物傳感器。與傳統(tǒng)的滴定法(GB 5009.226—2016)與比色法相比，該方法具有預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[20]，在食品檢測(cè)中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FeCl3(六水)、乙酸鈷(四水)、乙酸鎳(四水)、NaOH、H2O2、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、冰醋酸、醋酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4等化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18 MΩ·cm)。

SEM S-4800型掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；XRD-6000型X線衍射儀，日本SHIMADZU公司；UV1902PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海鳳凰科學(xué)儀器廠；CHI760D型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司(電化學(xué)測(cè)量采用三電極測(cè)量體系，工作電極為修飾過氧化物模擬酶的金電極，直徑2 mm，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極)。

1.2 鐵鈷鎳納米復(fù)合材料的制備的制備

金屬硫化物具有較好的過氧化物模擬活性，但所用的硫源通常是對(duì)環(huán)境不友好的H2S、Na2S或者硫脲等等。受Cova等[11]的啟發(fā),筆者從常見的生活廢料中尋找硫源。雞毛中富含角質(zhì)蛋白，含硫豐富，用雞毛作為硫源引入納米復(fù)合材料。

Fe納米復(fù)合物的制備如下：首先稱取0.4 g剪成2 mm左右的雞毛，加入50 mL NaOH溶液(0.1 mol/L)，超聲溶解得棕色的羽毛水解液。然后在水解液中加入1.08 g FeCl3，超聲10 min后，倒入聚乙烯內(nèi)襯的水熱反應(yīng)釜150 ℃反應(yīng)10 h,自然冷卻后，得到的沉淀分別用乙醇和水清洗2次，60 ℃真空干燥過夜，得Fe納米復(fù)合物。FeCo納米復(fù)合物以及FeCoNi納米復(fù)合物的制備過程類似，不同之處在于：將上述制備過程中的1.08 g FeCl3換為0.54 g FeCl3和0.498 g乙酸鈷制得FeCo納米復(fù)合材料；同理，將上述制備過程中的1.08 g FeCl3置換為0.54 g FeCl3、0.249 g乙酸鈷和0.249 g乙酸鎳，制得FeCoNi納米復(fù)合物。

1.3 3種材料的過氧化物模擬酶活性研究

3種材料的過氧化物模擬酶活性采用傳統(tǒng)的雙底物顯色反應(yīng)，即所制得的樣品材料催化H2O2與TMB的反應(yīng)，TMB從無色被氧化為藍(lán)色氧化態(tài)的TMBox，然后測(cè)量吸光度。具體過程如下：取4個(gè)1.5 mL的離心管(a、b、c、d)，a作為空白對(duì)照組，其中混合液組成為含有0.5 mmol/L H2O2和0.5 mmol/L TMB的0.1 mol/L、pH 4.0 的醋酸緩沖液；b中混合液組成為含有0.5 mmol/L H2O2、0.5 mmol/L TMB以及0.1 mg/mL Fe納米復(fù)合物的0.1 mol/L、pH 4.0的醋酸緩沖液；c中混合液組成為含有0.5 mmol/L H2O2、0.5 mmol/L TMB以及0.1 mg/mL FeCo納米復(fù)合物的0.1 mol/L、pH 4.0的醋酸緩沖液；d中混合液組成為含有0.5 mmol/L H2O2、0.5 mmol/L TMB以及0.1 mg/mL FeCoNi納米復(fù)合物的0.1 mol/L、pH 4.0的醋酸緩沖液。反應(yīng)30 min后拍照，各稀釋10倍后測(cè)吸光度。

1.4 3種材料的過氧化物模擬酶的米氏常數(shù)的測(cè)定

米氏常數(shù)是通過分析含有催化樣品的反應(yīng)體系在652 nm處的吸光度動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)公式：

(1)

式中：v表示最初反應(yīng)速率，min-1；vmax表示最大反應(yīng)速率，min-1；[S]表示底物的濃度，mmol/L；Km表示米氏常數(shù)[21-22]，mmol/L。

因該系統(tǒng)中有2個(gè)底物，使得其中一個(gè)底物的濃度過量，改變另外一個(gè)底物的濃度，可以考察另外一個(gè)底物的活性。為了考察過氧化物模擬酶對(duì)H2O2的親和力，固定TMB的終濃度為2 mmol/L，樣品終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，改變H2O2終濃度為0.1、0.15、0.20、0.25、0.3、0.4、0.8以及1 mmol/L，在0.1 mol/L、pH 4.0的醋酸緩沖液中于652 nm處測(cè)量吸光度，8 min內(nèi)終止，測(cè)量動(dòng)力學(xué)曲線。

1.5 過氧化物模擬酶修飾電極的制備

電極預(yù)處理。金電極使用水虎魚溶液(98%H2SO4和30%H2O2，體積比為7∶ 3)浸泡30 min以除去電極表面的雜質(zhì)，超純水沖洗干凈后，分別用0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光，然后在無水乙醇和超純水中超聲清洗各5 min，接著在0.5 mol/L的H2SO4溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安活化(1.6～-0.2 V)至獲得穩(wěn)定的掃描曲線，最后超純水洗凈，氮?dú)飧稍锎谩?/p>

納米復(fù)合物修飾電極的制備。取3 μL含有3 mg/mL過氧化物模擬酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Nafion溶液滴加到電極上，自然晾干待用。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

采用三電極體系，以金電極或過氧化物模擬酶修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。在含有5 mmol/L Fe(CN)63-/4-的 0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(0.6～-0.2 V，掃描速率0.1 V/s)和交流阻抗譜掃描以獲得電極修飾的表征數(shù)據(jù)；在含或不含H2O2的0.2 mol/L PB緩沖液(pH=6.0)中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(0～-0.8 V，掃描速率0.1 V/s)獲得修飾電極的可行性數(shù)據(jù)；在-0.6 V電位下，向攪拌的0.2 mol/L PB緩沖液(pH=6.0)中連續(xù)滴加H2O2儲(chǔ)備液(100 mmol/L)，得到電流(i)-時(shí)間(t)曲線，以獲得H2O2檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種材料結(jié)構(gòu)表征

首先對(duì)制備的材料進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)的表征，以確定材料的形貌，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可看出，制備的3種材料的形貌都不均一，F(xiàn)e納米復(fù)合材料(圖1(a))主要由納米棒與無定型的納米顆粒組成；FeCo納米復(fù)合材料主要由納米棒和納米片堆疊而成(圖1(b))；FeCoNi納米復(fù)合材料由無定形顆粒與納米棒組成(圖1(c))。同時(shí)對(duì)材料做X線衍射分析(XRD)(圖2)，通過與PDF卡片進(jìn)行比對(duì)，F(xiàn)e納米復(fù)合物中的主要成分為α-Fe2O3(PDF 85-0987)；FeCo復(fù)合物中的主要成分為(CoFe2)O4(PDF 79-1744)；FeCoNi納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)上與FeCo復(fù)合物相似，但是無定形的顆粒更多一些。

圖2 3種復(fù)合材料的XRD分析

圖1 復(fù)合材料的掃描電鏡圖

為了考察復(fù)合物中所含有的元素，筆者對(duì)FeCo納米復(fù)合物做了元素的X線能譜分析(EDS)，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可看出，F(xiàn)e、Co的原子百分含量分別為8.7%和4.6%，基本上符合(CoFe2)O4中的元素原子比值。因?yàn)椴牧现苽鋾r(shí)FeCo元素比是按1∶ 1添加的，這說明有一部分的Co沒有參與反應(yīng)而被沖洗掉了。材料中的S元素的原子含量大約為0.06%，說明通過該方法的確摻雜了部分S元素。

圖3 FeCo納米復(fù)合材料EDS能譜分析

2.2 過氧化物模擬酶活性探討及米氏常數(shù)的確定

筆者對(duì)3種材料的過氧化物模擬酶活性作了初步探討，結(jié)果如圖4所示。從圖4中內(nèi)插的照片可看出，反應(yīng)系統(tǒng)中含有制備的材料時(shí)，反應(yīng)30 min后都呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色，而空白對(duì)照反應(yīng)體系無色，這說明3種材料都具有過氧化物模擬酶的活性，但是c管的顏色最深，這說明FeCo納米復(fù)合材料的催化活性最好。從紫外可見吸收光譜圖也可看出，3種材料在652 nm處都出現(xiàn)了氧化態(tài)TMBox的特征吸收峰，吸收峰的強(qiáng)弱來看，F(xiàn)eCo納米復(fù)合物的催化活性最好，F(xiàn)eCoNi和Fe納米復(fù)合材料的催化活性都要弱一些。

(a)0.5 mmol/L H2O2+0.5 mmol/L TMB；(b)0.5 mmol/L H2O2+0.5 mmol/L TMB+0.1 mg/mL Fe納米復(fù)合材料；(c)0.5 mmol/L H2O2+0.5 mmol/L TMB+0.1 mg/mL FeCo納米復(fù)合材料；(d)0.5 mmol/L H2O2+0.5 mmol/L TMB+0.1 mg/mL FeCoNi納米復(fù)合材料

圖5 3種材料的雙倒數(shù)曲線

2.3 電極修飾表征

通過以上分析可知，F(xiàn)eCo納米復(fù)合材料的過氧化物模擬酶活性最好。因此筆者將FeCo納米復(fù)合材料修飾到金電極上(FeCo/Au電極)，用于H2O2的測(cè)量，并對(duì)組裝過程的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示。從圖6(a)可看出,裸金電極的循環(huán)伏安曲線(CV)峰電流為32 μA，F(xiàn)eCo/Au 電極的CV峰電流為5.8 μA，這說明FeCo納米復(fù)合材料減小了電子傳遞速率，并成功修飾到了電極表面。圖6(b)是2種裸電極與修飾電極的交流阻抗譜(EIS)，圖中插圖為交流阻抗等效電路，其中Rs為溶液電阻，Rct為電子傳遞電阻，Zw為擴(kuò)散電阻，Cdl為雙電層電容，圖6中半圓直徑代表了Rct的大小。從圖6可看出，裸電極的Rct為1 985 Ω，隨著電極表面FeCo材料的修飾，電子轉(zhuǎn)移速率降低，Rct增加到3 889 Ω。這進(jìn)一步說明可以通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% Nafion溶液將材料固定到電極表面。

圖6 裸電極和FeCo納米復(fù)合物修飾電極在含有5 mmol/L Fe(CN)63-/4-的0.1 mol/L KCl中的循環(huán)伏安曲線(0.1 V/s)(a)；交流阻抗譜(b)

2.4 FeCo納米材料修飾電極對(duì)H2O2檢測(cè)的可行性分析

在0.2 mol/L PB 緩沖液(pH=6.0)中，筆者對(duì)電極做了電化學(xué)CV表征，結(jié)果如圖7所示。從圖7(a)中可看出，裸電極(a，b)在不含H2O2以及2.0 mmol/L H2O2的緩沖液中，都沒有氧化還原峰，說明裸電極不能催化H2O2的還原。當(dāng)電極表面修飾上FeCo納米復(fù)合材料后，在含有2 mmol/L H2O2的緩沖液中，-0.6 V處出現(xiàn)了明顯的還原峰，這說明FeCo納米復(fù)合材料具有良好的電催化性能。從圖7(b)中可看出，隨著H2O2濃度的增加(1.0、2.0、2.5以及3.0 mmol/L)，F(xiàn)eCo/Au 電極在溶液中的還原電流隨之增加，說明該材料可以制備H2O2傳感器。

圖7 電極在0.2 mol/L、pH 6.0 PB緩沖液中的循環(huán)伏安曲線(0.1 V/s)

通過改變CV的掃描速率來研究該H2O2傳感器的H2O2催化反應(yīng)的控制步驟(圖8)。從圖8(a)看出，隨著掃描速率從10增加到200 mV/s，H2O2還原電流逐漸增加。將-0.6 V處的還原電流與掃速的平方根作圖(圖8(b))，得到良好的線性關(guān)系，這說明在電極表面的催化反應(yīng)速率很快，反應(yīng)過程可能是擴(kuò)散控制的，為了降低傳質(zhì)過程對(duì)反應(yīng)的影響，可增強(qiáng)對(duì)流傳質(zhì)過程(如攪拌)。

圖8 修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安曲線(2.0 mmol/L H2O2)(a)及還原電流與掃速平方根之間的線性關(guān)系(b)

2.5 計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)H2O2的濃度

在-0.6 V電位下，向攪拌的0.2 mol/L PB緩沖液(pH=6.0)中連續(xù)滴加H2O2儲(chǔ)備液(100 mmol/L)，得到電流i-時(shí)間t曲線，結(jié)果如圖9所示。從圖9(a)看出，F(xiàn)eCo/Au電化學(xué)傳感器對(duì)H2O2的還原響應(yīng)在3 s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。圖9(b)是濃度-電流標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1 000 μmol/L濃度以下，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為i=0.014 1c+8.042(R2=0.998)；在大于1 000 μmol/L濃度時(shí)，擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為i=0.007 4c+13.618(R2=0.997)，檢測(cè)限(3σ/s)為4.94 μmol/L。

表1為該電化學(xué)傳感器與其他H2O2傳感器的性能比較。從表1可看出，該傳感器的檢測(cè)限(LOD)與已有的一些H2O2傳感器是可比的，檢測(cè)范圍也更寬一些，同時(shí)檢測(cè)限低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.226—2016)中的定量限3 mg/kg，即88.2 μmol/L，這說明該傳感器具有一定的應(yīng)用潛力。

表1 該電化學(xué)傳感器與其他過氧化氫傳感器的性能比較

2.6 傳感器的抗干擾性能、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在測(cè)試過程的最后(圖9(a))，滴加了終濃度為10 mmol/L抗壞血酸(a)和10 mmol/L小牛血清蛋白(b)，結(jié)果并沒有產(chǎn)生電流響應(yīng)，表明該傳感器具有良好的抗干擾性能。

圖9 FeCo修飾電極對(duì)不同濃度H2O2的i—t響應(yīng)曲線(-0.6 V，0.2 mol/L，PB緩沖液)(a)；標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)

用該傳感器平行測(cè)定400 μmol/L的H2O25次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%，說明該傳感器的重現(xiàn)性是可接受的。將制備好的傳感器置于4 ℃冰箱保存，每周測(cè)量一次(400 μmol/L)，4周后響應(yīng)電流仍能保持在90%，說明該傳感器的穩(wěn)定性比較好。

2.7 食品樣品中H2O2的檢測(cè)

為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可靠性，筆者對(duì)牛奶、腐竹(干)和水發(fā)牛百葉進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。某國產(chǎn)嬰兒奶粉用溫水沖調(diào)至0.1 g/mL，PB緩沖液調(diào)至pH 6.0，冷卻至室溫進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)；將瀝干水分后的牛百葉和腐竹樣品分別粉碎均勻，準(zhǔn)確稱取10 g，適量水溶解，PB緩沖液調(diào)至pH 6.0，然后定容至100 mL，搖勻并浸泡30 min，過濾后濾液直接進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。

表2 食品樣品中H2O2的檢測(cè)

從表2可看出，該嬰兒奶粉中沒有檢測(cè)出H2O2，添加標(biāo)樣后，回收率在97.0%～100.5%，對(duì)于色澤白亮好看的腐竹和牛百葉樣品，檢測(cè)出了H2O2殘留。對(duì)于所有的食品樣品，該傳感器的RSD不大于4.2 %，在可接受的范圍之內(nèi)，說明該傳感器具有實(shí)際應(yīng)用于食品檢測(cè)的潛力。

3 結(jié)論

采用水熱合成法制備了3種具有過氧化物模擬酶活性的納米復(fù)合材料，將其中催化活性最好的FeCo納米復(fù)合材料修飾于金電極表面，制備了用于檢測(cè)過氧化氫的電化學(xué)傳感器。結(jié)果表明該傳感器具有快速及穩(wěn)定的電化學(xué)響應(yīng)、較寬的線性范圍(80～5 640 μmol/L)和較低檢測(cè)限(4.94 μmol/L)，檢測(cè)限低于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中(GB 5009.226—2016)的定量限3 mg/kg，即88.2 μmol/L，在實(shí)際的食品樣品檢測(cè)中也展現(xiàn)了良好的效果，說明該傳感器在食品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。