睪酮人工抗原的合成及酶聯(lián)免疫方法的建立

高 璐，孫嘉笛，王利平，紀 劍，孫秀蘭

(江南大學 食品學院 食品科學與工程國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

睪酮(testosterone，T)是哺乳動物體內常見的具有性激素作用的一種類固醇激素，具有提高生殖器官的發(fā)育、調節(jié)生殖代謝過程的作用[1]。包括睪酮在內的性激素具有較強的蛋白質同化作用，使動物肉質品質得到改善，提高飼料的轉化效率和出欄率[2-3]，經(jīng)常被添加在畜禽等飼料中，給商家?guī)順O高的養(yǎng)殖效益。激素濫用導致的動物及人的健康問題越來越嚴重[4]，長期攝入激素會導致人體內分泌紊亂，損害肝、腎等器官，從而大大增加致癌、致畸的風險[5-7]。

針對動物源食品中激素超標的現(xiàn)象，我國已出臺了相關的法律法規(guī)，如《關于嚴禁非法使用獸藥的通知》《獸用處方藥和非處方藥管理辦法》《中華人民共和國農業(yè)部公告第235號》[8-9]和《食品中獸藥最大殘留限量》[10]等。國際上，歐盟理事會第96/22/EC號指令禁止以促進生長為目的在肉食性動物中添加自然或人工合成的性激素，以確保歐盟內的人類健康保護[11]。如今，國內外社會仍存在非法添加包括睪酮在內的性激素事件，為了確保人類的食品安全和健康，建立相關簡便、靈敏的檢測技術是當務之急。

目前，睪酮傳統(tǒng)的理化檢測方法包括液相色譜-質譜(LC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS)、毛細管電泳法、熒光光譜分析法和拉曼光譜法等方法[12-14]。其中，LC-MS有較高的分離能力和鑒別能力，電泳法和熒光光譜法所需樣品量和試劑消耗量少，拉曼光譜法對樣品前處理極為簡單[15]。但是上述方法或多或少存在技術缺陷和條件不足，比如耗費較高，實驗操作人員需要具有專業(yè)的技術，對實驗儀器和實驗條件的要求高，而且準備工作耗時長等[15]。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是在免疫酶方法基礎上發(fā)展起來的一種新型免疫測定手段[16]，具有特異性強、靈敏、簡便、準確和樣品通量高等優(yōu)點[17]。睪酮是小分子物質，屬于半抗原，只有當其與載體蛋白結合后，才能獲得其包被原性[18]。梁康建等[19]研制了檢測己烯雌酚殘留的ELISA試劑盒，歷經(jīng)為期較長的實驗，該試劑盒可以用于豬肉、雞肉、魚肉及飼料等樣品的批量檢測，因其目標物為雌激素，無法做到對睪酮的特異性檢測，并且國內市面上幾乎沒有對睪酮殘留檢測的ELISA試劑盒。

當前，人們對食品安全的呼聲越來越高，開發(fā)一種用于對食品中殘留的睪酮進行高效、便捷檢測的技術勢在必行。本文中，筆者應用混合酸酐法得到睪酮人工抗原，并進行結構鑒定，同時與睪酮單克隆抗體結合，建立一種睪酮酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

睪酮標準品、羧甲基羥胺半鹽酸(CMO)、N，N-二甲基甲酰胺、卵清蛋白(OVA)、睪酮單克隆抗體，Sigma公司；氯甲酸異丁酯，F(xiàn)luka公司；三乙胺，上?；瘜W試劑公司；羊抗兔IgG，北京博奧森有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Spectronicl.70型紫外可見分光光度計，意大利GBC公司；NICOLET NEXUS470型傅里葉變換紅外光譜儀，美國熱電公司；MK3酶標儀，上海智理科學儀器有限公司；微型凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 睪酮肟化及人工抗原的合成

用高濃度反應液一步合成法將睪酮肟化[20]。1 mmol睪酮標準品溶于無水吡啶，加入2 mmol CMO，50 ℃攪拌反應30 min，減壓蒸餾去吡啶。殘余物用乙酸乙酯溶解，加適量水清洗，取上層油樣，加入少量無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾去乙酸乙酯，殘余物用乙醚重結晶搗碎得到肟化后的睪酮半抗原。

采用混合酸酐法[21]將半抗原與OVA偶聯(lián)，得到睪酮包被抗原。睪酮半抗原用N,N-二甲基甲酰胺攪拌溶解，加入三乙胺，4 ℃下反應1 h，加入氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應l h，同時將OVA溶于磷酸鹽緩沖液中，加入N,N-二甲基甲酰胺，4 ℃下攪拌反應1 h，逐滴滴加上面半抗原反應好的產(chǎn)物，4 ℃條件下反應4 h。先后用磷酸緩沖液和蒸餾水透析2 d，期間多次換液，冷凍干燥即得到偶聯(lián)蛋白后的睪酮人工抗原(T-OVA)。

1.3.2 人工抗原的鑒定

1)紫外掃描光譜法鑒定。取睪酮、OVA標準品以及制備好的T-OVA，用50%甲醇-水溶液作稀釋液，稀釋至一定濃度后進行紫外掃描光譜鑒定，用石英比色皿，稀釋液作參比溶液，在200～400 nm波長范圍內檢測其特征吸收峰[22]。

2)紅外光譜法鑒定。取睪酮、OVA標準品以及制備好的T-OVA按1∶ 150(質量比)加入干燥的KBr粉末，置于瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下研磨、混勻，裝壓片模具在 8 000 N壓力下加壓，制得厚度1 mm的透明KBr樣品晶片，上機檢測[23]。

3)SDS-PAGE電泳鑒定。取OVA標準品和制備好的T-OVA稀釋至一定濃度，根據(jù)蛋白電泳預制膠試劑盒說明書進行制膠、上樣、電泳、染色、脫色等步驟，觀察脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質樣品移動距離[24]。

1.3.3 間接競爭ELISA標準曲線的建立

用碳酸鹽緩沖液稀釋制備好的人工抗原，滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后倒去包被液，洗滌液清洗后拍干，封閉液滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后洗滌拍干。按照間接競爭ELISA法，參照文獻[25]繪制標準曲線，檢測限LOD=3σ/S，其中σ為空白樣品標準差，S為斜率。

1.3.4 樣品加標回收實驗

將樣品分別按照0、1、5、10和20 μg/L 5個水平添加睪酮標準品。取2 g組織(豬肉)均勻物，加入6 mL乙腈溶液，充分振蕩2 min，在4 500 r/min、15 ℃條件下離心10 min，取上清液4 mL，在56 ℃條件下N2吹至完全干燥。加入2 mL正己烷充分溶解，再加入1 mL去離子水振蕩，在4 500 r/min、15 ℃條件下離心5 min后，去上層液相，取下層液相與50%甲醇-PBS溶液以體積比1∶ 1混合，用于分析，每個濃度取4個平行組。

2 結果與討論

2.1 人工抗原結構鑒定

2.1.1 紫外吸收光譜驗證人工抗原

將睪酮、OVA標準品以及制備好的T-OVA稀釋至一定濃度后進行紫外掃描光譜鑒定，在200～400 nm波長范圍內檢測其特征吸收峰，結果如圖1所示。由圖1可知，睪酮半抗原在255 nm處有典型吸收，OVA標準品在280 nm處有最大吸收峰，而T-OVA 包被原的最大吸收峰則位于220 nm處，這說明睪酮人工抗原偶聯(lián)物最大吸收峰發(fā)生藍移，并與其前體物質有不同的紫外吸收特征，初步表明偶聯(lián)成功。

圖1 T、OVA和T-OVA的紫外吸收譜圖

2.1.2 紅外光譜驗證人工抗原

對睪酮、OVA標準品以及制備好的T-OVA進行紅外光譜分析，結果如圖2所示。由圖2可知，睪酮標準品在3 300 cm-1處有一個強吸收峰，這是羥基的特征峰，而人工抗原T-OVA無此吸收峰，表明半抗原衍生化成功。同時，OVA標準品和T-OVA免疫原在2 500～3 200 cm-1和1 660～1 500 cm-1的區(qū)域內具有相似的吸收峰，這是OVA標準品中氨基酸的特征峰，說明合成的包被原中含有OVA，證明T-OVA中含有睪酮。據(jù)此確定T-OVA人工抗原偶聯(lián)成功。

圖2 T、OVA和T-OVA的紅外譜圖

2.1.3 SDS-PAGE電泳驗證人工抗原

所得人工抗原SDS-PAGE電泳圖如圖3所示。由圖3可知，OVA標準品的條帶相比T-OVA的條帶較深且寬，向下移動的距離稍遠，表明T-OVA的遷移速率比OVA的遷移速率小，偶聯(lián)后包被原的分子量比載體OVA的分子量大，證明偶聯(lián)抗原制備成功。

圖3 OVA和T-OVA的SDS-PAGE電泳圖

2.2 間接競爭ELISA標準曲線

按照間接競爭ELISA法，以睪酮標準品質量濃度為0、1、5、10、20、25 μg/L進行OD值的測定。以睪酮標準溶液的質量濃度對數(shù)為橫坐標，以抑制率為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線如圖4所示，曲線在1～25 μg/L范圍內線性關系良好，檢測限可達到0.261 7 μg/L，相關系數(shù)R=0.995 6。(B為OD值，B0為對照組OD值，下同。)

圖4 睪酮ELISA檢測標準曲線

2.3 睪酮ELISA檢測穩(wěn)定性測試

用碳酸鹽緩沖液稀釋睪酮包被抗原，滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后倒去包被液，洗滌液清洗后拍干，封閉液滴加在孔板中，37 ℃孵育2 h后洗滌拍干，待孔板晾干后真空包裝，于-20 ℃保存。分別于第3天、第7天、第10天、第14天進行ELISA方法檢測，結果如圖5所示。由圖5可知，擬合線性關系幾乎重疊，且表1顯示5次測定時間所得批間差異(CV)均小于5%。

圖5 睪酮ELISA檢測的穩(wěn)定性結果

表1 睪酮ELISA檢測穩(wěn)定性結果差異值

2.4 樣品加標回收試驗

樣品分別按照0、1、5、10、20 μg/L 5個水平添加睪酮標準品，結果如表2所示。

表2 睪酮ELISA檢測的樣品加標回收結果

由表2可知，基于睪酮激素建立的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測法對樣本的平均加標回收率為87.51%～102.83%，說明建立的睪酮ELISA檢測法具有很高的準確度，可以應用于實際樣品中睪酮的檢測。

3 結論

采用混合酸酐法合成睪酮人工包被抗原，與睪酮單克隆抗體結合，建立了一種檢測靈敏度高、方法簡單、高效的酶聯(lián)免疫檢測方法，所得標準曲線在1～25 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(shù)R=0.995 6，最低檢測限可達0.261 7 μg/L。檢測方法穩(wěn)定性測試中，5次測定時間所得批間差異均小于5%，樣品加標回收率為87.51%～102.83%，可應用于實際樣品中睪酮的檢測。本研究為進一步自主開發(fā)高效率且應用于市場的睪酮ELISA檢測試劑盒奠定基礎，同時為保障我國肉制品質量安全提供一種有效的技術手段。