骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15基因與卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵巢儲備功能的關(guān)系*

胡新新 林如茵 施琦蓉 陳彩虹 高宏志

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建省泉州市 362000

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)是目前發(fā)現(xiàn)的一種主要的卵源性因子，同屬于轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p)超家族，在卵泡正常發(fā)育、排卵和卵母細(xì)胞成熟過程中都發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。為探討B(tài)MP15在卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者刺激周期卵母細(xì)胞成熟過程中的表達(dá)變化及意義，本研究對91例患者(其中35例為卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者)卵母細(xì)胞BMP15的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，旨在探討B(tài)MP15基因與卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵巢儲備功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2016年1月—2017年6月在醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的、因男方因素不孕而接受ICSI治療的91例患者，其中卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者35例(觀察組)和卵巢功能正常的婦女56例(對照組)。對照組婦女的入選標(biāo)準(zhǔn)為：月經(jīng)規(guī)律(月經(jīng)周期為21～35d)，基礎(chǔ)體溫測試證實(shí)有正常排卵，超聲證實(shí)卵巢形態(tài)正常，雄激素水平正常，且基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)水平<10U/L，體質(zhì)指數(shù)(BMI)在18.5～23.0范圍之內(nèi)。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等；曾接受過卵巢手術(shù)或放化療者；近3個月內(nèi)接受過促排卵治療或服用性激素者。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，并且所有患者簽署知情同意書。兩組患者的一般情況見表1。

表1 兩組婦女的一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案：所有觀察對象均采用標(biāo)準(zhǔn)長方案，即在上1個月經(jīng)周期的黃體中期用促性腺激素釋放激素的激動劑(GnRH-a)進(jìn)行垂體的降調(diào)節(jié)，在本次月經(jīng)周期的第2、3天用重組人卵泡刺激素(rhFSH)啟動，啟動劑量為75～300IU/d，并根據(jù)年齡、竇卵泡數(shù)目、基礎(chǔ)FSH水平以及以往治療周期的卵巢反應(yīng)性進(jìn)行劑量調(diào)整；之后每3～4天經(jīng)陰道B超監(jiān)測卵泡的生長情況，并同時監(jiān)測血清黃體生成素(LH)、雌二醇和孕酮的水平，以此調(diào)節(jié)促性腺激素(Gn)的劑量。當(dāng)有1個卵泡直徑達(dá)18mm或2個卵泡直徑達(dá)17mm或3個卵泡直徑達(dá)16mm時，當(dāng)日停用rhFSH，單次臀部肌內(nèi)注射hCG 10 000U，34～36h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵[3-4]。

1.2.2 巢式實(shí)時定量：以β肌動蛋白(β-actin)的表達(dá)水平作為參照。探針序列為BMP15：5’-FAM-TGGCATATACAGATCCTGGGCTTT-TAMRA-3’；β-actin：5’-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3’。第1輪PCR反應(yīng)條件為：93℃5min，93℃30s，55℃45s，72℃45s共30個循環(huán)，72℃延伸7min。第2輪PCR反應(yīng)條件為：93℃3min，然后93℃30s，55℃45s，共40個循環(huán)。每例標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，取其均值用于統(tǒng)計(jì)分析。以目的基因與β-actin的吸光度(A)的比值表示BMP15 mRNA的相對表達(dá)水平[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組患者臨床資料的比較采用t檢驗(yàn)；由于部分?jǐn)?shù)據(jù)為非正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)的秩和檢驗(yàn)方法，以中位數(shù)(M)和第25及第75百分位數(shù)表示。

2 結(jié)果

對照組刺激周期卵母細(xì)胞BMP15 mRNA的表達(dá)水平GⅤ期高于MⅠ期，MⅠ期低于MⅡ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間比較，觀察組BMP15在GⅤ期顯著低于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組刺激周期不同成熟階段卵母細(xì)胞BMP15 mRNA的表達(dá)[M，(P25，P75)]

3 討論

本研究結(jié)果顯示，在非卵巢內(nèi)膜異位囊腫且卵巢功能正常婦女卵母細(xì)胞成熟的不同階段，BMP15 mRNA的表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著性變化，在成熟階段表達(dá)水平最高[6-8]。王鶴[9]利用原位雜交技術(shù)檢測了人類從始基卵泡到小竇卵泡階段卵母細(xì)胞中BMP15 mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在卵泡生長的早期階段，卵源性因子的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，與本研究結(jié)果一致，值得注意的是，MⅠ期卵母細(xì)胞中BMP15 mRNA的表達(dá)水平與GV期和MⅡ期比較均較低，與甘霏霏等[10]的結(jié)果不一致，MⅠ期卵母細(xì)胞的主要變化是生殖泡裂解和減數(shù)分裂重新啟動，由此推測，在胞核劇烈變化的過程中，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平也發(fā)生相應(yīng)變化，可能引起B(yǎng)MP15 mRNA表達(dá)水平的下降。

卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者在促排卵刺激下的卵母細(xì)胞隨著核發(fā)育成熟，BMP15的表達(dá)水平均未表現(xiàn)出動態(tài)性變化，且處于低水平狀態(tài)。該結(jié)果提示，卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細(xì)胞對外源性Gn反應(yīng)低下，并存在胞質(zhì)發(fā)育不成熟以及核質(zhì)發(fā)育不同步[11-13]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，MⅡ期卵母細(xì)胞中BMP15的表達(dá)水平觀察組低于對照組，提示經(jīng)過促排卵的刺激，觀察組卵母細(xì)胞中卵源性因子的表達(dá)在成熟階段未能達(dá)到正常水平。一項(xiàng)類似研究發(fā)現(xiàn)[14]，在卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者成熟卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞中，GDF9的表達(dá)顯著低于正常水平；另外，該研究還采用免疫熒光的方法對卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者和卵巢功能正常婦女的未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行檢測，分析了MⅠ期卵母細(xì)胞中BMP15的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BMP15在兩組婦女未成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá)無明顯差異。由于卵源性因子參與卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)，推測卵源性因子的表達(dá)水平降低可能影響卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細(xì)胞—卵丘復(fù)合體(OCC)的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育潛能受損。由于本研究所用卵母細(xì)胞均來自卵巢刺激周期，與生理狀態(tài)下的卵母細(xì)胞可能存在差異[15]。生理狀態(tài)下卵母細(xì)胞中卵源性因子的表達(dá)是否也存在同樣的變化，需要在以后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，在刺激周期中，卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者成熟卵母細(xì)胞中卵源性因子表達(dá)水平降低，可能影響細(xì)胞質(zhì)成熟，從而導(dǎo)致卵巢內(nèi)膜異位囊腫患者卵母細(xì)胞質(zhì)量下降和發(fā)育潛能受損。