刺五加苷B對(duì)疲勞小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其激活 Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的機(jī)制

張 倩，馮晴霞，周正乙，李睿祺，方 雷，楊秋楠，盛 瑜，盧學(xué)春，杜培革，安麗萍

(1. 北華大學(xué)藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2. 解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853)

疲勞是由于長時(shí)間運(yùn)動(dòng)后造成體力和腦力損耗，從而對(duì)人們身體和心理產(chǎn)生影響的一種生理現(xiàn)象[1]。機(jī)體的能源物質(zhì)耗竭且供應(yīng)不足、自由基積累脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)和代謝產(chǎn)物堆積不能及時(shí)分解均為產(chǎn)生疲勞的主要原因[2]。長時(shí)間運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生變化，引起神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)能改變，也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗氧化功能減弱，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力[3-4]。

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)系五加科植物的干燥根和根莖，具有抗癌、抗輻射、抗衰老和抗疲勞等功能，其主要的活性單體成分為刺五加苷B(eleutheroside B，ELB)和刺五加苷E(eleutheroside E，ELE)，ELB占刺五加總苷的45%[5-8]。ELB是刺五加抗疲勞的主要活性成分，但其抗疲勞的機(jī)制尚不明確。研究[9]顯示：ELB對(duì)PC12細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用，可增強(qiáng)其抗氧化能力。有關(guān)ELB對(duì)疲勞小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文作者以游泳訓(xùn)練致疲勞的小鼠為模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化指標(biāo)檢測、HE染色和Western blotting法檢測，觀察ELB對(duì)疲勞小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，為刺五加活性成分的利用和相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器60只雄性ICR小鼠(吉林省長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(吉)-2018-0007，體質(zhì)量為(20±2)g。ELB(ID：QZ3Y-Y3AD；111574-201605，中國食品藥品檢定研究院)，乳酸(lactic acid,LD)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogebase,LDH)試劑盒、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒和三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphase,ATPase)試劑盒(南京建成生物工程研究院)，活性氧簇(reactive oxygen,ROS)試劑盒、谷氨酸(glutamic acid,GLU)試劑盒、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)試劑盒和γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，BCA蛋白定量測定試劑盒、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)和血紅素加氧酶1(home oxygenase 1,HO-1)(北京鼎盛昌盛生物技術(shù)有限公司)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。MT-200 Morris水迷宮分析儀、BA-200小鼠避暗儀和DT-200小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀(成都泰盟科技有限公司)，Infinite M200型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司)，低溫高速離心機(jī)(美國 Eppendorf 公司)，Western blotting 凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀 (美國Bio-Red公司)，多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) (北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥方式靜坐實(shí)驗(yàn)：保持小鼠的正常生活，不施加任何外界干擾。游泳實(shí)驗(yàn)：采用游泳實(shí)驗(yàn)制備小鼠疲勞模型，將小鼠置于水深為20 cm的恒溫(20 ℃±2 ℃)水箱中進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，第1天游泳30 min，第2天40 min，從第3天開始每天1 h，共4周。

將60只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只。對(duì)照組：灌胃給予蒸餾水，靜坐實(shí)驗(yàn)； 模型組：灌胃給予蒸餾水，游泳實(shí)驗(yàn)； ELB(C)組：灌胃給予80 mg·kg-1ELB，靜坐實(shí)驗(yàn)； ELB(M)組：灌胃給予80 mg·kg-1ELB，游泳實(shí)驗(yàn)。每天灌胃1次，共4周。

1.3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30 min后，使DT-200小鼠轉(zhuǎn)棒測試儀保持30 r·min-1的轉(zhuǎn)速，小鼠先進(jìn)行3次適應(yīng)訓(xùn)練后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30 min后開始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于水迷宮裝置中游泳2 d，保持每天2 min，使各組小鼠適應(yīng)環(huán)境。定位航行測試：恒溫水池(25℃±2 ℃，r=60 cm，h=50 cm)中放置1個(gè)低于水面1 cm的玻璃平臺(tái)(r=2.5 cm)，并加入適量二氧化鈦(TiO2)。測試6 d，將小鼠面對(duì)水池壁放入恒溫水池中游泳，儀器自動(dòng)記錄小鼠找到平臺(tái)時(shí)間。若2 min未上臺(tái)，則逃避潛伏期記為120 s。

1.5 避暗實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30 min后，先將小鼠置于BA-200小鼠避暗儀中充分適應(yīng)環(huán)境，在暗室給予一個(gè)5 min的持續(xù)電流，當(dāng)小鼠進(jìn)入時(shí)將遭受電擊，逃回明室。從實(shí)驗(yàn)開始到小鼠第一次遭受電擊的時(shí)間即為避暗潛伏期，最長潛伏期為5 min。記錄小鼠5 min之內(nèi)遭受電擊的總次數(shù)，即為避暗錯(cuò)誤次數(shù)。

1.6 小鼠血清和腦組織中各生化指標(biāo)檢測末次給藥30 min后，小鼠眼球取血，離心制備血清。采血后迅速取小鼠腦組織，稱質(zhì)量并用生理鹽水漂洗，備用。采用比色法檢測小鼠血清中LD水平，采用微量酶標(biāo)法檢測小鼠血清中LDH活性，脲酶法檢測小鼠血清中BUN水平，羥胺法檢測小鼠腦組織中SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測小鼠腦組織中MDA水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測小鼠腦組織中ROS、eNOS、GABA和GLU水平，分光光度法檢測小鼠腦組織中ATPase活性。血清中LDH活性(U·L-1)=[(測定A值-對(duì)照A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×1 000，血清中LD和BUN水平(mmol·L-1)=[(測定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)，ATPase活性(μmol Pi·mg-1prot·h-1)=[(測定A值-對(duì)照A值)/標(biāo)準(zhǔn)A值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.5 mol·L-1)×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)(2.5)×6/勻漿蛋白濃度(g·L-1)。

1.7 Western blotting法檢測小鼠腦組織中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平末次給藥30 min后，取小鼠腦組織在冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清。根據(jù)BCA蛋白定量測定試劑盒具體步驟嚴(yán)格操作，測定小鼠腦組織的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離各蛋白，冷水浴中電轉(zhuǎn)膜70 min，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBS-T封閉1 h，棄封閉液，分別加入一抗β-actin、Keap1、Nrf2和HO-1，4 ℃搖床過夜。TBS-T洗膜5次(15 min/次)，加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBS-T洗膜5次(15 min/次)，ECL 顯影液顯色。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 HE染色觀察小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)末次給藥30 min后，取小鼠全腦，投入 4% 多聚甲醛中固定，進(jìn)行冰凍切片，HE 染色按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間與對(duì)照組比較，模型組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間明顯縮短(P<0.05)，ELB(C)組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間延長(P<0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間明顯延長(P<0.05)，且各組小鼠第2天的轉(zhuǎn)棒時(shí)間均較第1天延長。見表1。

表1 各組小鼠的轉(zhuǎn)棒時(shí)間

2.2 各組小鼠逃避潛伏期定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸縮短。在實(shí)驗(yàn)第5和6天，與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，ELB(C)組小鼠逃避潛伏期縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)第6天ELB(M)組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見圖1。

*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs model group.

2.3 各組小鼠避暗潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)各組小鼠避暗潛伏期隨著時(shí)間的增加有不同程度的延長。與對(duì)照組比較，模型組小鼠避暗潛伏期縮短(P<0.05)，ELB(C)組小鼠避暗潛伏期延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠避暗潛伏期明顯延長(P<0.05)。各組小鼠避暗錯(cuò)誤次數(shù)隨著時(shí)間的延長均有不同程度的減少。與對(duì)照組比較，模型組小鼠5 min內(nèi)避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.05)，ELB(C)組小鼠避暗錯(cuò)誤次數(shù)減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，ELB(M)組小鼠避暗錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠避暗實(shí)驗(yàn)中避暗潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)

2.4 各組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平明顯升高(P<0.05)；ELB(C)組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠血清中LDH活性和LD及BUN水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中LDH活性和 LD及BUN水平

2.5 各組小鼠腦組織中SOD活性及MDA、ROS、eNOS水平和GLU/GABA比值與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值降低(P<0.05)，MDA和ROS水平升高(P<0.05)；ELB(C)組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值升高，MDA和ROS水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中SOD活性、eNOS水平和GLU/GABA比值升高(P<0.05)，MDA和ROS水平降低(P<0.05)。見表4。

2.6 各組小鼠腦組織中ATPase活性與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性降低(P<0.05)；ELB(C)組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性升高(P<0.05)。見表5。

表4 各組小鼠腦組織中各項(xiàng)生化指標(biāo)

表5 各組小鼠腦組織中ATPase活性

2.7 Western blotting法檢測各組小鼠腦組織中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中Keap1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織中Keap1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖2和表6。

2.8 各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組小鼠腦組織海馬區(qū)椎體細(xì)胞排列緊密有序，大小均勻，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見；模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列松散，層次不清，間隙增大，部分海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)有明顯的病理學(xué)改變；與對(duì)照組比較，ELB(C)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增多，層次清晰，排列較為緊密有序，細(xì)胞形態(tài)均一；與模型組比較，ELB(M)組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元排列更緊密有序，間隙減少，層次更加清晰，細(xì)胞形態(tài)和體積趨于正常。見圖3(插頁六)。

Lane 1：Control group；Lane 2：Model group；Lane 3：ELB(C) group；Lane 4：ELB(M) group.

表6 各組小鼠腦組織中 Keap1、Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)水平

3 討 論

超過耐受量的劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生明顯的運(yùn)動(dòng)性疲勞，這時(shí)機(jī)體由有氧供能變成無氧糖酵解，使LD在體內(nèi)積累，蛋白質(zhì)分解加強(qiáng)，體內(nèi)BUN水平升高，導(dǎo)致肌肉酸痛，使機(jī)體產(chǎn)生疲勞感同時(shí)運(yùn)動(dòng)耐力降低，而血清中 LDH水平反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)肌肉損傷的程度[10-11]。本研究通過游泳實(shí)驗(yàn)建立了運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠模型，采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力情況，結(jié)果顯示：模型組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間明顯縮短，表明疲勞小鼠模型建立成功；與模型組比較，給予ELB干預(yù)后，疲勞小鼠血清中LD水平、LDH活性和BUN水平降低，提示ELB可加快LD的代謝，有效緩解疲勞。

疲勞可以引起機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能和抗氧化功能改變，從而使學(xué)習(xí)記憶力降低[12-13]。疲勞時(shí)體內(nèi)自由基不能得到有效清除，ROS積累在引起神經(jīng)元損傷并導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的同時(shí)，也造成eNOS 脫偶聯(lián)，NO 水平下降和氧自由基水平升高，致使具有抗氧化作用的自由基清除酶SOD 活性降低，反映自由基損傷的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高等[14-17]。本研究結(jié)果顯示：疲勞模型小鼠水迷宮潛伏期延長，避暗潛伏期縮短、錯(cuò)誤次數(shù)增加，小鼠腦組織中SOD活性和eNOS水平降低，MDA和ROS水平升高，說明疲勞小鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙；ELB干預(yù)后，疲勞小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期縮短，避暗潛伏期延長、錯(cuò)誤次數(shù)減少，小鼠腦組織中SOD活性和eNOS水平升高，MDA和ROS水平降低，說明ELB可有效增強(qiáng)疲勞小鼠抗氧化能力。疲勞小鼠體內(nèi)ROS水平降低，則會(huì)使腦組織線粒體Ca2+內(nèi)流減少，線粒體內(nèi)ATPase的活性增高，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)GLU及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的比值升高[18-20]，可降低腦內(nèi)神經(jīng)元損傷及受體功能障礙，改善疲勞小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在本研究中，給予ELB干預(yù)后，疲勞小鼠腦組織中Na+K+-ATPase、Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性及GLU/GABA比值均升高，小鼠海馬區(qū)結(jié)構(gòu)層次清晰，排列較為緊密有序，提示ELB可以通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用，從而改善疲勞小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中，Nrf2是關(guān)鍵因子，Keap1是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)因子，正常情況下Keap1會(huì)與Nrf2在細(xì)胞漿結(jié)合，維持細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的穩(wěn)定，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激環(huán)境中時(shí)，Keap1與Nrf2解偶聯(lián)，活化的Nrf2會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和編碼細(xì)胞內(nèi)解毒酶的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞[21-24]。而HO-1是Nrf2/ARE通路調(diào)控的重要抗氧化酶，受Nrf2調(diào)控。本研究結(jié)果顯示：ELB干預(yù)后，疲勞小鼠腦組織中Keap1蛋白表達(dá)水平降低， Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高，說明ELB改善疲勞小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)與調(diào)控Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，ELB能夠改善疲勞小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，具體機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。本研究為刺五加的開發(fā)和利用奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。