線粒體靶向KillerRed增強輻射誘導(dǎo)HeLa細胞自噬作用及其機制

于 雷，王 策，韓 冰，李 鑫，韓雨辰，孫宇瑩，郭湘舒，劉威武，王志成

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130021；2. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林 長春 130041；3. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長春 130041；4. 吉林省腫瘤醫(yī)院放療醫(yī)技科，吉林 長春130012)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類由線粒體產(chǎn)生的活性分子，作用于線粒體后可以導(dǎo)致線粒體膜電位(mitochondrial membrance potential, MMP)的降低和線粒體呼吸鏈的損傷，進而引起線粒體失能，并誘導(dǎo)細胞自噬[1-3]。本課題組前期研究[4-5]顯示：線粒體靶向KillerRed(mitochondrion-targeted KillerRed,mtKR)可以增強輻射所致的細胞增殖抑制和凋亡，但其具體機制尚未明確。在本研究中，以構(gòu)建的mtKR質(zhì)粒Pink1-mtKR轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細胞，采用可見光和4 Gy X射線聯(lián)合照射后，檢測細胞MMP和氧化呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性等功能指標(biāo)，并檢測自噬和PTEN誘導(dǎo)假定激酶1/帕金蛋白(PTEN-induced putative kinase 1/parkin，Pink1/parkin)調(diào)控通路相關(guān)蛋白表達，闡明mtKR對輻射誘導(dǎo)的線粒體失能和細胞自噬的作用，探討其相關(guān)的分子調(diào)控機制，為增強宮頸癌放療效果提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人宮頸癌HeLa細胞由本實驗室保存。MEM完全培養(yǎng)基(美國Gibico公司)，Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑(上海翊圣生物科技有限公司)，青、鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific公司)，羅丹明123、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ水平檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin, MDC，美國Sigma公司)，線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Pink1、parkin和線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20(transcocase of outer mitochondrial membrance 20,Tom20)多克隆一抗(美國ImmunoWay公司)，P62多克隆一抗(美國CST公司)，熱休克蛋白60(heat shock protein 60，Hsp60)和GAPDH兔多克隆一抗(美國Bioworld公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國Santa Cruz公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。多功能微孔板檢測儀(美國Biotek公司)，X射線輻照儀(型號X-RAD 320iX，美國Precision X-ray股份有限公司)。

1.2 實驗分組和照射HeLa細胞分為對照組、空載體組、Pink1-mtKR組、對照 +4 Gy X射線照射組、空載體+4 Gy X射線照射組和Pink1-mtKR+4 Gy X射線照射組。無菌條件下避光可見光源照射細胞[5]，時間為30 min，12 h后X射線照射，條件為電壓 180 kV，電流12.0 mA，靶皮距70 cm，劑量率 1.0 Gy·min-1，單次照射劑量為4 Gy。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞MMP和自噬率取對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于24孔板中，細胞密度為0.7×105個/孔，瞬時轉(zhuǎn)染空載體和Pink-mtKR質(zhì)粒，30 h后給予30 min可見光照射，12 h后進行4 Gy X射線照射，于24 h時收集各組細胞，PBS洗滌3次。檢測MMP時，加入300 μL PBS，重懸細胞，加入羅丹明123(終濃度5 μmol·L-1)于37℃避光反應(yīng)30 min，上機檢測，以平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)表示MMP。加入10 mL MDC (5 mmol·L-1)，37℃靜置30 min后，1 000 r·min-1離心5 min，棄廢液，加入4%多聚甲醛1 mL避光條件下固定15 min，離心后加入PBS洗滌1次，上機檢測細胞自噬率。

1.4 細胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平檢測HeLa細胞瞬時轉(zhuǎn)染后，進行可見光照射和4 Gy X射線照射，24 h后按5 ×107個細胞加入1.0 mL提取液的比例加入提取液，用勻漿器在冰上勻漿，按照試劑盒說明書提取線粒體蛋白，并分別按照試劑盒說明書檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平。

1.5 Western blotting法檢測細胞中Pink1、parkin、P62和Tom20蛋白表達量HeLa細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染后，進行可見光和4 Gy X射線照射，24 h后分別提取總蛋白和線粒體蛋白，并測定蛋白濃度。40 μg蛋白變性后上樣，濃縮膠80 V，分離膠120 V，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜緩沖液4℃中過夜?jié)褶D(zhuǎn)；5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入Pink1、parkin、P62和Tom20一抗(采用TBST配置，1∶1 000)、GAPDH和HSP60一抗(1∶500)，37℃孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)后37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒進行反應(yīng)，暗室中曝光，并拍照觀察目的蛋白表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞MMP可見光與對照組比較，照射后24 h，Pink1-mtKR組HeLa細胞MMP明顯降低(P<0.05)，對照+ 4 Gy X射線照射組、空載體+4 Gy X射線照射組和Pink1-mtKR+4 Gy X射線 照射組HeLa細胞MMP降低更明顯(P<0.05)；與對照+4 Gy X射線照射組比較，Pink1-mtKR + 4Gy X射線照射組細胞MMP明顯降低(P<0.05)，且低于Pink1-mtKR組(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 可見光和X射線照射后24 h各組細胞MMP及線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平

A: Control group; B: Empty vector group; C: Pink1-mtKR group; D: Control+4 Gy X-ray irradiation group; E: Empty vector+4 Gy X-ray irradiation group; F: Pink1-mtKR+4 Gy X-ray irradiation group.

2.2 各組細胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平與對照組比較，可見光照射后24 h，Pink1-mtKR組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平明顯降低(P<0.05)，對照+4 Gy X射線照射組、空載體+4 Gy X射線照射組和Pink1-mtKR+4 Gy X射線照射組細胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平降低更明顯(P<0.05或P<0.01)；與對照+4 Gy X射 線照射組比較，Pink1-mtKR + 4 Gy X射線照射組細胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平明顯降低(P<0.05)，且低于Pink1-mtKR組(P<0.05)。見表1。

2.3 各組細胞自噬率與對照組比較，可見光照射后12 h，空載體組和Pink1-mtKR組細胞自噬率明顯變化(P>0.05)；照射后24 h，Pink1-mtKR組細胞自噬率明顯升高(P<0.05)?？梢姽夂? Gy X射線聯(lián)合照射后12和24 h，與對照組比較，對照+4 Gy X射線照射組、空載體+4 Gy X射線 照射組和Pink1-mtKR+4 Gy X射線照射組細胞自噬率均明顯升高(P<0.05)。與對照+4 Gy X射線 照射組比較，照射后24 h，Pink1-mtKR+4 Gy X射線照射組細胞自噬率明顯升高(P<0.05)；照射后12和24 h，Pink1-mtKR +4 Gy X射線照射組細胞自噬率明顯高于Pink1-mtKR組(P<0.05)。見表2和圖2。

表2 可見光和X射線照射后12和24 h各組HeLa細胞自噬率

A-F: 12 h; G-L: 24 h;A, G: Control group; B, H: Empty vector group; C, I: Pink1-mtKR group; D, J: Control+4 Gy X-ray irradiation group; E, K: Empty vector+4 Gy X-ray irradiation group; F, L: Pink1-mtKR+4 Gy X-ray irradiation group.

2.4 各組細胞中自噬相關(guān)蛋白表達量在總蛋白中，各組細胞中Pink1、parkin和Tom20蛋白表達量無明顯變化，但Pink1-mtKR組P62蛋白表達量增加，Pink1-mtKR+4 Gy X射線照射組增加更明顯；在線粒體蛋白中，Pink1-mtKR組和Pink1-mtKR + 4 Gy X射線照射組細胞中Pink1、parkin和Tom20蛋白表達量均增加。見圖3。

A: Total protein；B: Mitochondrial protein;Lane 1:Control group; Lane 2: Empty vector group; Lane 3: Pink1-mtKR group; Lane 4: Control+4 Gy X-ray irradiation group; Lane 5: Empty vector+4 Gy X-ray irradiation group; Lane 6: Pink1-mtKR+4 Gy X-ray irradiation group.

3 討 論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，對于中晚期宮頸癌患者，放射治療是首選治療方式[6-7]。放射治療主要通過射線的直接作用而損傷細胞；射線間接作用時，主要通過自由基對細胞產(chǎn)生作用。ROS主要由氧化磷酸化途徑產(chǎn)生，此過程依賴于線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平。低水平ROS能夠發(fā)揮細胞正常生理功能，而高水平ROS則誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，損傷線粒體，甚至損傷線粒體DNA[8]。正常生理條件下，ROS可以被抗氧化系統(tǒng)清除，一旦ROS產(chǎn)生過量，則會損傷線粒體和細胞[9-10]。而線粒體是作為細胞主要的能量和代謝源，也是ROS的重要靶點。如何通過靶向線粒體改變其功能而提高治療腫瘤效果，已引起研究者的廣泛關(guān)注。基于過量ROS可導(dǎo)致氧化損傷的理論，放療可以通過誘導(dǎo)ROS而致細胞凋亡和自噬，達到殺傷腫瘤細胞的目的[11-13]，大量的實驗證據(jù)也證明了這一點。如何誘導(dǎo)足量的ROS并且靶向線粒體，最終殺傷腫瘤細胞，是一個重要的研究方向。

研究[4-5]顯示：基于線粒體靶向的序列Pink1介導(dǎo)mtKR蛋白，可以實現(xiàn)線粒體靶向誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，且增加輻射誘導(dǎo)的HeLa細胞增殖抑制，可能與促進凋亡有關(guān)，但其他機制仍需進一步研究。線粒體主要功能包括產(chǎn)生ATP，90%的ATP由線粒體產(chǎn)生，并在線粒體膜上產(chǎn)生MMP，MMP降低時主要發(fā)生線粒體失能表型，而線粒體失能會導(dǎo)致后續(xù)的細胞凋亡、自噬和侵襲過程[14-15]。在本研究中，轉(zhuǎn)染了Pink1-mtKR質(zhì)粒的HeLa細胞中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ水平較對照組和空載體組明顯降低，且MMP也明顯降低，證明Pink1-mtKR在可見光誘導(dǎo)下可以引起HeLa細胞的線粒體失能。線粒體失能在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，ROS的產(chǎn)生進一步損傷線粒體的電子傳遞鏈[16]。

已有文獻[17-19]顯示：線粒體ROS產(chǎn)生和線粒體脂質(zhì)的氧化在細胞自噬中起重要作用，是自噬的重要參與者。Pink1存在于大多數(shù)線粒體膜中，但通常會降解。當(dāng)發(fā)生線粒體損傷時，Pink1不會降解，會使parkin募集并磷酸化，從而引發(fā)線粒體自噬，Pink1敲除小鼠表現(xiàn)出線粒體呼吸活動受損和對氧化應(yīng)激的敏感性增加[20]。上述結(jié)果表明：Pink1/parkin在線粒體自噬和ROS調(diào)節(jié)的線粒體生成中起作用。許多線粒體自噬的調(diào)節(jié)因子可以受到ROS的調(diào)節(jié)，通過ROS誘導(dǎo)MMP降低，可看作是線粒體自噬的一種信號。本研究通過mtKR誘導(dǎo)HeLa細胞線粒體失能，闡明了mtKR在光誘導(dǎo)下導(dǎo)致HeLa細胞自噬的相關(guān)機制，即KR靶向線粒體，通過ROS導(dǎo)致MMP去極化，Pink1在線粒體外膜大量累積，招募parkin并使其磷酸化，從而泛素化各種外膜蛋白，進而招募 P62等蛋白，以啟動線粒體自噬。

本研究結(jié)果表明：Pink1-mtKR轉(zhuǎn)染的HeLa細胞經(jīng)可見光和X射線照射后可以誘導(dǎo)MMP和線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ水平均降低，mtKR可增加由輻射誘導(dǎo)的細胞自噬，且與Pink1/parkin線粒體自噬途徑有關(guān)。mtKR引起的線粒體失能和最終的細胞死亡為腫瘤的輻射增敏提供了一個新的思路。

*吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級