樓家暉 楊鶇祥 鄭明軒 楊永菊 王洪旭
1.遼寧中醫(yī)藥大學,遼寧 沈陽 110032 2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以成熟骨量減少,骨組織結(jié)構(gòu)破壞,骨強度受損,極易發(fā)生骨痛等疾病的全身性骨病。研究表明[1],現(xiàn)有的西藥、雌激素等防治手段具有誘導(dǎo)惡性腫瘤、骨壞死等不良反應(yīng),而中藥復(fù)方具有整體治療及副作用小的優(yōu)點,是防治骨質(zhì)疏松癥的新方向。臨床實踐證實,中醫(yī)“腎主骨生髓”“肝主筋”理論指導(dǎo)下的中藥復(fù)方對骨密度(bone mineral density,BMD)增加、成骨細胞的形成及骨生物力學特性具有促進作用[2-5]。本實驗通過研究“強筋健骨方”對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)大鼠骨密度及生物力學的影響,為下一步臨床試驗提供實驗基礎(chǔ)。
選用60只3月齡未經(jīng)產(chǎn)雌性SD大鼠,體質(zhì)量(204±16) g,購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號:SCXK(遼).2015-0001。
強筋健骨方配制:組成:淫羊藿、懷牛膝等。用去離子水將顆粒配置成藥液,于4℃冰箱密封保存,灌胃前水浴法加熱至37℃,超聲混勻,冷卻至室溫(25℃);尼爾雌醇片(大連美侖生物技術(shù)有限公司,批號:15020302)。
三點力學生物儀,上海能共實業(yè)有限公司,DMS 雙能 X 線骨密度儀(型號:starosDR)。
除Sham組外,其余組均采用如下所述造模方法:全程嚴格按照無菌操作進行,術(shù)前禁食8 h,不禁水。配制2%戊巴比妥鈉溶液(40 m/kg),提捏大鼠后頸部肌肉,伸直右側(cè)大腿,肌注麻醉后,術(shù)區(qū)被皮、碘伏消毒,切口部位選取大腿根部向上1.5 cm 處,用手術(shù)刀片切開表皮、肌肉等組織,找到淡粉色卵巢,牽出淡粉色卵巢,結(jié)扎卵巢與子宮結(jié)合部,剪去卵巢。術(shù)區(qū)用碘伏消毒后,分籠飼養(yǎng),暖光燈照射,維持大鼠體溫,自由攝取食物與水,密切觀察大鼠情況。術(shù)后切口邊緣注射青霉素20萬單位抗菌消炎。Sham組僅取卵巢旁1 cm3大小脂肪組織進行切除,不進行結(jié)扎輸卵管與切除卵巢等操作,其余處置同上。
60只大鼠隨機分為6組,每組10只,分別為Sham組、OVX組、E2組、“強筋健骨方”低、中、高劑量組(JGG、JGZ、JGD)。造模后,Sham、OVX組給予等量生理鹽水,E2組給藥濃度12 μg/(kg·d),“強筋健骨方”三劑量組(分別相當于成人劑量1、2、3倍)分別給予制備好的“強筋健骨方”水煎液,低中高組給藥濃度分別為5.56 g/(kg·d)、11 g/(kg·d)、22 g/(kg·d)。
1.6.1BMD測定:定將麻醉后大鼠仰臥位平放于骨密度儀測試臺上,最大程度伸展大鼠股骨,使股骨充分暴露于X線下,打開骨密度儀掃描雙側(cè)股骨,測量骨密度數(shù)值。
1.6.2骨礦含量(bone mineral content,BMC)測定:含量剔出大鼠雙側(cè)側(cè)股骨,清理周圍肌肉組織,干燥箱中(溫度90 ℃)烘干1 h,天平稱重(精確度:0.1 mg)。電爐炭化后置入馬福爐(800 ℃)2 h,待骨灰冷卻后,電子天平稱重。3%硝酸溶液10 L分別加入0.05 g和0.1 g灰質(zhì),移至25 L的比色管中,室溫下放置48 h,溶液呈無色透明,測試骨礦含量。
1.6.3骨組織形態(tài)學觀察:取股骨用4%多聚甲醛溶液固定,EDTA脫鈣液脫鈣,以長針可刺入為準。流水過夜沖洗股骨,定量濃度乙醇浸泡,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察骨組織形態(tài)。
1.6.4骨生物力學測定:應(yīng)用骨生物力學方法來進行骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究是其中較好的手段,可反映骨的宏觀力學效應(yīng)及骨質(zhì)性能(強度、硬度、韌性等)之間的關(guān)系。目前,骨質(zhì)疏松研究中用來評價長骨生物力學性能的試驗主要是三點彎曲試驗,可以良好地反映骨質(zhì)疏松動物長骨的生物力學變化,而且具有操作方便的優(yōu)點[6]。其中,測定的結(jié)構(gòu)力學指標包括反映骨內(nèi)在性能指標彈性模量(Young modulus)、骨應(yīng)力(Maximum stress)和骨外在性能指標最大負荷(Maximum load)、結(jié)構(gòu)硬度(Stiffness)及能量吸收 (Energy)等[7]。
實驗步驟:實驗采用CTM2050S萬能拉力試驗機,取右股骨全長,放入室溫下的生理鹽水當中浸泡3 h,取出恢復(fù)室溫,兩端用黏膠澆鑄后放在間距為22 mm三點壓縮實驗臺上,標本橫截面短軸的方向與加速度方向一致,最大加載速度2 mm/min,啟動壓力架開關(guān),待股骨斷裂后計算機得出各生物力學數(shù)據(jù)。
實驗結(jié)果表示為均數(shù)±標準差,SPSS 20.0版軟件分析,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊采用t檢驗,不齊采用非參數(shù)檢驗。
與OVX組相比,其余組大鼠骨密度差異均有統(tǒng)計學意義,且OVX組BMD值明顯小于其余組(P<0.01);與E2相比,JGG組差異有統(tǒng)計學意義,且BMD值大于E2組(P<0.01);“強筋健骨方”三組相比,JGD與JGG差異有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值小于JGG組(P<0.01);與OVX組相比,除JGD組外其余組差異均有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值均大于OVX組(P<0.05);與E2組相比,“強筋健骨方”三組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);“強筋健骨方”三組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。
表1 各組大鼠股骨骨密度及骨礦含量的比較
骨應(yīng)力、彈性模量為反映骨生物力學較為特異性指標,OVX組與其余組除JGD組外相比,骨應(yīng)力與彈性模量差異均有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值均大于OVX組(P<0.05);E2組與強筋健骨方三劑量組相比,骨應(yīng)力與JGD組差異有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值大于JGD組(P<0.01),彈性模量與JGZ、JGD組相比差異有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值大于中低組(P<0.05);強筋健骨方三組比較,骨應(yīng)力JGG組與JGD組差異有統(tǒng)計學意義,且JGG組大于JGD組(P<0.01),彈性模量JGG組與其余組比較差異有統(tǒng)計學意義,且數(shù)值大于其余組(P<0.05)。見表2。
將股骨切片光鏡下顯示,Sham組骨小梁排列整齊,骨小梁較為飽滿,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,骨髓腔??;OVX組骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞,骨小梁之間間隙變大,連接性變差,骨髓腔變大;E2組遭到破壞骨小梁明顯減少,骨小梁相對飽滿,骨小梁排列整齊,尚可連接成網(wǎng),髓腔較??;“強筋健骨方”三劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)改善顯著,骨小梁相比OVX組間距縮短,排列整齊,髓腔減小。見圖1。
表2 各組大鼠股骨生物力學性能比較Table 2 Comparison of biomechanics of the femur among the
圖1 各組大鼠股骨HE 染色結(jié)果(10×10)Fig.1 He staining results of the femurs of rats in each group(10×10)
據(jù)相關(guān)調(diào)查[8],中國大陸接近14億的人口中,患有骨質(zhì)疏松癥的人群接近20%(40歲以上),因OP帶來的骨折、全身性骨痛等問題嚴重影響人們的健康,骨質(zhì)疏松癥在中國古代屬于“骨萎”的范疇。在“未病防變”的思想下,基于“肝主筋”“脾主肉”“腎主骨”理論,以“養(yǎng)肝、健脾、補腎”為根本治法,促使機體達到“筋強、肉實、骨豐”的生理狀態(tài),從而防治骨質(zhì)疏松癥。本文從“補腎、活血”治法為切入點進行復(fù)方對OP治療作用的研究,通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),這類中藥復(fù)方確有促進骨形成,抑制骨吸收,從而起到防治OP的作用[9]。OP的治療除了滋補三臟來化生氣血、強筋健骨之外,還應(yīng)注重活血利氣,以此達到OP的治療目的,一些以活血利氣的復(fù)方在OP大鼠的基因表達方面,確能產(chǎn)生一種或者幾種物質(zhì)(如血管內(nèi)皮生長因子),在骨組織的生長、發(fā)育與修復(fù)過程中(包括大鼠BMD、VEGF蛋白含量及mRNA表達量)起著重要作用[10]。從而提出了“補臟器以調(diào)氣血,調(diào)氣血以利筋骨,臟腑調(diào)達,筋強骨健”的理論,并將該理論進行深化,研制出治療OP的效方“強筋健骨方”,將其進行實驗研究,并為下一步的臨床研究提供實驗基礎(chǔ)。
本實驗采用PMOP大鼠模型,該種OP動物模型是1969年由Saville建立[11],是目前研究絕經(jīng)后OP最常見、最可靠的動物模型之一[12]??偨Y(jié)相關(guān)文獻,發(fā)現(xiàn)中藥及復(fù)方具有改善實驗大、小鼠生物力學、骨形成、骨吸收、BMD等指標的作用[13-24]。如蒙海燕等[25]用鹿茸及鹿角膠對去勢大鼠灌胃后發(fā)現(xiàn)大鼠的骨密度、骨礦物含量及骨組織形態(tài)學都有一定程度的改善;韋大文等[26]再用補腎方治療去勢大鼠OP后,大鼠骨組織形態(tài)學如骨松質(zhì)、骨小梁結(jié)構(gòu)等都有了明顯的改善;毛春煥等[27]在用骨松健骨方治療去勢OP大鼠后,大鼠骨小梁數(shù)目增加,骨小梁間隙降低,骨生物力學性能也得到了明顯的提升。
實驗通過三點彎曲試驗、BMD、BMC及骨組織形態(tài)學來探究強筋健骨方對OP模型的骨生物力學的影響。去勢致大鼠OP導(dǎo)致BMD下降,有效骨量降低,骨密質(zhì)變薄,骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞從而導(dǎo)致骨生物力學的改變,容易發(fā)生骨折[28-30]。彈性模量及骨應(yīng)力是骨生物力學性能的綜合體現(xiàn),與骨骼的長短尺寸關(guān)系較小,可以較為可靠地展現(xiàn)材料的內(nèi)在生物力學特性[31-32]。結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組大鼠生物力學性能明顯下降,通過觀察股骨彈性模量及股骨骨應(yīng)力,可反映出OVX組大鼠骨外在的宏觀力學性能明顯減退。與OVX組去勢雌鼠相比較,E2組及強筋健骨方高、中劑量組的最大負荷、彈性模量及骨應(yīng)力均顯著提高,JGD組也有所提高,猜測強筋健骨方在減少骨吸收,促進骨生成的同時,還提高了股骨的生物力學特性,使其不易發(fā)生骨折,并且本實驗還發(fā)現(xiàn)股骨生物力學特性優(yōu)劣與給藥劑量有一定的相關(guān)性。
研究表明[33],去勢后大鼠血清ER含量減少會使甲狀旁腺功能亢進,進而引發(fā)過多的甲狀旁腺素分泌,致使骨吸收旺盛,骨形成抑制,從而降低BMD,誘發(fā)OP。OVX組BMD、BMC值均小于Sham組與、E2組,說明造模成功,正符合造模PMOP大鼠生理特性。與OVX組相比,JGG、JGZ組BMD與BMC數(shù)值均明顯大于OVX組;與E2相比較,JGG、JGD組BMD均顯著提高,雖然BMD組骨礦含量增高與模型組相比較不具有統(tǒng)計學意義;強筋健骨方三組間比較,JGG組BMD值大于其余兩組。綜合分析,強筋健骨方三組可以顯著提高股骨密度及骨礦含量的作用,且JGG組表現(xiàn)較為優(yōu)越。
實驗結(jié)果顯示強筋健骨方能夠有效增加PMOP大鼠BMD與BMC的作用,并且可以有效改善骨小梁結(jié)構(gòu)、縮小骨小梁及骨髓腔間隙,對恢復(fù)去勢大鼠骨質(zhì)微循環(huán)結(jié)構(gòu)有明顯促進作用,從而提高大鼠股骨生物力學特性,增加骨質(zhì)強度以治療PMOP大鼠。