昆蟲病原真菌長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜的侵染過程和致病力

張挺峰, 王 睿, 劉長仲,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室, 蘭州 730070; 2. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 甘肅張掖 734000)

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum，又稱豆蚜、豆無網(wǎng)長管蚜，隸屬于昆蟲綱(Insecta)半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)無網(wǎng)蚜屬Acyrthosiphon，廣泛地分布于世界各地，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一(賀春貴, 2004)，主要為害豌豆Pisumsativum、蠶豆Viciafaba、紫花苜蓿Medicagosativa和扁豆Lablabpurpureus等多種豆科作物和牧草(Caillaudetal., 2002; Andarge and Van Der Westhuizen, 2004; Edwards and Singh, 2006; Gaoetal., 2008; 呂寧和劉長仲, 2014; Soleimani and Madadi, 2015)。豌豆蚜以成蚜和若蚜群集于葉片背面、嫩莖、嫩梢上吸食汁液，致使葉片卷縮、變黃，植物營養(yǎng)損失、發(fā)育受阻甚至全株枯死(楊彩霞等, 2005; Goggin, 2007)。除直接取食為害外，豌豆蚜取食時分泌大量蜜露影響植物的光合作用和呼吸作用，其唾液還可傳播30余種病毒，造成的經(jīng)濟(jì)損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其直接為害的損失。

目前，蚜蟲最主要的防治方法是化學(xué)防治，長期化學(xué)殺蟲劑的使用導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性、再猖獗、次要害蟲上升、農(nóng)藥殘留等影響人畜健康、食品安全和環(huán)境質(zhì)量的一系列問題(Carrow,1986; Scottetal., 1998; Bielza, 2008; Gaoetal., 2012)。在過去的幾十年里，利用昆蟲病原真菌控制害蟲被視為化學(xué)措施的替代或補(bǔ)充，昆蟲病原真菌流行病的發(fā)生，可自然制約害蟲的種群數(shù)量，維持生態(tài)平衡，減少化學(xué)農(nóng)藥的用量，降低防治成本，減少環(huán)境污染。Hajek和St Leger (1994)研究了蠟蚧輪枝菌Verticilliumlecanii對蚜蟲的侵染過程，將其概括為6個階段：分生孢子附著落于蟲體表面、孢子萌發(fā)、表面菌絲鋪展、侵入表皮、侵害發(fā)展和次生分生孢子的形成。而由于不同寄主體壁形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致孢子在體壁上萌發(fā)、侵入等的方式和速度不同，進(jìn)而產(chǎn)生對不同昆蟲致病性的差異。長孢蠟蚧菌Lecanicilliumlongisporum是一種高致病性的昆蟲病原真菌，其宿主范圍廣泛，包括昆蟲、螨蟲、蜘蛛、線蟲和植物病原真菌等，已被列為多種害蟲的實用性生物防治劑(Kimetal., 2007)，但其侵染豌豆蚜的過程和殺蟲機(jī)理未見報道。為了揭示長孢蠟蚧菌侵染豌豆蚜的特點及其致病機(jī)理，本研究以前期分離鑒定的豌豆蚜致病真菌長孢蠟蚧菌TF-2菌株(張挺峰等, 2020)為材料，通過不同濃度分生孢子浸染豌豆蚜，分析其致病力，并在顯微及超微狀態(tài)下揭示長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜的侵染特征，為開發(fā)和利用該菌株在田間或溫室防治豌豆蚜奠定相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

豌豆蚜僵蚜采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗基地(蘭州安寧區(qū))，先用75%乙醇消毒3 s，再用滅菌蒸餾水洗滌3次，放入1.5 mL離心管，加入0.5 mL滅菌蒸餾水，用組織勻漿器勻漿蟲體并稀釋10倍。取20 μL在PDA培養(yǎng)基上用涂布棒涂抹均勻，于恒溫培養(yǎng)箱中(SPX-250-GB，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)在25±1℃, 75%±5% RH, 光周期16L∶8D條件下培養(yǎng)5 d，用接種針挑取不同菌落的少量菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待各菌落生長10 d后，用2 mL 0.01% Tween-80無菌水沖洗各菌落獲得分生孢子懸浮液，浸染豌豆蚜進(jìn)行回接試驗?；亟釉囼灚@得一株具有高致死率菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS序列測定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對致病菌株進(jìn)行分子鑒定，確定該菌株為長孢蠟蚧菌L.longisporumTF-2 菌株(GenBank登錄號: MG834532) (張挺峰等, 2020)，保存至4℃冰箱備用。

1.2 供試蚜蟲

供試豌豆蚜于2017年5月采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗基地(蘭州安寧區(qū))，將無翅胎生雌蚜單頭飼養(yǎng)在盆栽蠶豆V.faba‘Lincan 2’(臨蠶2號，購于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)植株上，進(jìn)行單克隆系培養(yǎng)，作為供試蟲源。 在溫度25±1℃、相對濕度50%±10%、光周期16L∶8D的條件下飼養(yǎng)，挑選個體大小一致的無翅成蚜供試。

1.3 分生孢子懸浮液制備

將保存于4℃冰箱TF-2菌株接種在PDA培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)10 d，收集分生孢子。分生孢子液用2 mL 0.01% Tween-80無菌水沖洗菌落，在顯微鏡下配制分生孢子5個處理濃度梯度分別為: 1.0×103～1.0×107孢子/mL。

1.4 長孢蠟蚧菌TF-2菌株致病力測定

采用浸漬法(Yu, 2016)和改進(jìn)的離體葉片培養(yǎng)法(Feng and Johnson, 1991)測定致病力。用毛筆挑選個體大小基本一致的無翅成蚜，分別浸入不同濃度TF-2菌株孢子懸浮液(1.0×103, 1.0×104, 1.0×105, 1.0×106和1.0×107孢子/mL)中，3～5 s后挑出，自然晾干。

選擇浸漬處理后活動自如無殘缺個體接入新鮮潔凈蠶豆葉片上，用浸濕的棉團(tuán)包裹葉柄，置于底鋪濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)內(nèi)，在濾紙上滴無菌水保濕，每葉接蟲5頭，各濃度處理樣本30頭蚜蟲，設(shè)置3個重復(fù)。用0.01% Tween-80無菌水處理作對照(CK)。

接入蚜蟲后將培養(yǎng)皿放入溫度25±1℃，相對濕度75%±5%，光周期16L∶8D的恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)蚜蟲，每隔12 h觀察1次，觀察蚜蟲發(fā)病癥狀，用體視顯微鏡(SteREO Discovery.V12, Carl Zeiss, 德國)拍照，統(tǒng)計死亡率，并將死蚜和若蚜及時清除。蠶豆葉柄棉花團(tuán)適時補(bǔ)水，每隔3 d更換一次葉片。

1.5 掃描電鏡觀察

用1.3節(jié)制備好的TF-2菌株孢子懸浮液(1.0×107孢子/mL)浸漬豌豆蚜成蟲后在離體葉片上飼養(yǎng)(方法同1.4節(jié))，分別于接種后12, 24, 48, 72和96 h取樣，然后用2.5%戊二醛溶液固定2-3 h以上，保存于70%乙醇中。從70%乙醇中取出樣品，放入濃度為80%， 85%， 90%， 95%和100%的乙醇中逐級脫水，每級脫水10 min，然后自然干燥(郭素枝和季清娥, 2001)，噴金，置于掃描電鏡(JSM-5600LV, 日本電子光學(xué)公司)下觀察，拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件對不同濃度分生孢子處理豌豆蚜累計死亡率進(jìn)行統(tǒng)計分析，半致死濃度(LC50)和半致死時間(LT50)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜成蟲致病力

長孢蠟蚧菌TF-2菌株不同濃度分生孢子浸染豌豆蚜成蟲，隨著孢子濃度加大，死亡時間縮短，死亡率相應(yīng)增大。接種3 d后，豌豆蚜死亡率開始顯著升高，浸染6 d內(nèi)最低濃度(1.0×103孢子/mL)孢子懸浮液處理豌豆蚜成蟲引起的累計死亡率為45.6%，而最高濃度(1.0×107孢子/mL)孢子懸浮液引起的累計死亡率達(dá)到100%(圖1)。 不同濃度分生孢子懸浮液浸染豌豆蚜成蟲6 d后，LC50的回歸方程為y=0.51(±0.05)x-2.32(±0.25)，LC50=3.26×104孢子/mL。TF-2菌株對豌豆蚜成蟲的LT50隨分生孢子濃度增大而逐漸變短，最低濃度(1.0×103孢子/mL)分生孢子處理豌豆蚜成蟲時，LT50為7.29 d，最高濃度(1.0×107孢子/mL)處理時LT50為2.92 d(表1)。

圖1 長孢蠟蚧菌TF-2菌株不同濃度分生孢子 處理的豌豆蚜成蟲6 d累計死亡率Fig. 1 Cumulative mortality of Acyrthosiphon pisum adults treated by Lecanicillium longisporum strain TF-2 at different conidial concentrations in 6 d CK: 0.01% Tween-80無菌水Sterilized water containing 0.01% Tween-80.

表1 長孢蠟蚧菌TF-2菌株不同濃度分生孢子對豌豆蚜成蟲的半致死時間(LT50)Table 1 Median lethal time (LT50) of Lecanicillium longisporum strain TF-2 at different conidial concentrations to Acyrthosiphon pisum adults

2.2 長孢蠟蚧菌TF-2菌株侵染豌豆蚜的侵染癥狀

體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，1.0×107孢子/mL的長孢蠟蚧菌TF-2菌株孢子懸浮液接種2 d后，豌豆蚜成蟲活動能力下降，行動遲緩，蟲體顏色由紅色逐漸變淺，在足關(guān)節(jié)、觸角、腹管末端等有白色菌絲生長(圖2: B, C)，3 d后體色轉(zhuǎn)暗身體開始僵硬(圖2: D)，4 d后蟲體布滿白色菌絲(圖2: E)，5 d后蟲體干癟菌絲體發(fā)達(dá)(圖2: F)。而對照組豌豆蚜成蟲體色保持紅色不變(圖2: A)，行動自如。

圖2 體視顯微鏡觀察的長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜成蟲的侵染癥狀Fig. 2 Symptoms of Acyrthosiphon pisum adults infected by Lecanicillium longisporum strain TF-2 observed under stereoscopic microscopeA: 對照組蟲體顏色保持紅色不變Body color of the control group remained red; B: 接種2 d后腹管變暗并著生菌絲Cornicle turned dark and hyphae grew at 2 d post inoculation; C: 接種2 d天后，蟲體顏色變淺Body colour became lighter and hyphae grew on the leg joints at 2 d post inoculation; D: 接種3 d后蟲體僵硬顏色發(fā)暗Body was stiff and dark at 3 d post inoculation; E: 侵染4 d后蟲體布滿菌絲Body was covered with mycelium at 4 d post infection; F: 侵染5 d后蟲體干癟布滿菌絲Body was wizened and covered with mycelium at 5 d post infection. 處理組中成蟲用1.0×107孢子/mL孢子懸浮液浸漬，對照組則用0.01% Tween-80無菌水浸漬，后在離體葉片上飼養(yǎng)；圖3同。Adults were immersed in conidial suspension at the concentration of 1.0×107 conidia/mL in the treatment group and in sterilized water containing 0.01% Tween-80 in the control group, and then reared on leaves in vitro. The same forFig. 3.

2.3 長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜的侵染過程

豌豆蚜成蟲在1.0×107孢子/mL的長孢蠟蚧菌TF-2菌株孢子懸浮液中浸漬后分別于12, 24, 48, 72和96 h取樣固定，進(jìn)行掃描電鏡觀察。電鏡觀察結(jié)果顯示，接種后12 h，分生孢子附著在蟲體表皮上(圖3: A)；接種后24 h，分生孢子萌發(fā)形成芽管和附著胞(圖3: B, C)；接種后48 h，芽管伸長形成菌絲在表皮上繼續(xù)伸長(圖3: D)，并在蚜蟲復(fù)眼、觸角基部、足基節(jié)、腹末生殖節(jié)等部位形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖3: D, E, F)；接種后96 h，菌絲布滿蟲體全身，新的分生孢子產(chǎn)生(圖3: G, H)。

圖3 掃描電鏡觀察的長孢蠟蚧菌TF-2菌株分生孢子對豌豆蚜成蟲侵染過程Fig. 3 Infection process of the conidia of Lecanicillium longisporum strain TF-2 to Acyrthosiphon pisum adults observed under scanning electron microscopeA: 接種后12 h, 分生孢子附著在表皮上Conidia attached to the epidermis at 12 h post inoculation; B, C: 接種后24 h, 分生孢子萌發(fā)形成芽管和附著胞Conidia germinated to form a bud tube and appressorium at 24 h post inoculation; D, E, F: 接種后48 h, 菌絲生長形成網(wǎng)絡(luò)Hypha grew to form a network at 48 h post inoculation; G, H: 接種后96 h，產(chǎn)生分生孢子Conidia formed at 96 h post inoculation. Ap: 附著胞Appressorium; Co: 分生孢子Conidia; Hp: 菌絲Hyphae.

3 討論

昆蟲病原真菌作為生物防治的一個重要組成部分，在持續(xù)控制蟲害、保護(hù)生態(tài)平衡方面具有不可替代的作用(Shah and Pell, 2003)。本研究利用前期分離鑒定的豌豆蚜致病真菌長孢蠟蚧菌TF-2菌株進(jìn)行致病力和侵染方式研究，結(jié)果表明，長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜成蟲具有較強(qiáng)的致病力，其分生孢子侵染方式為先附著，然后萌發(fā)形成芽管和附著胞，芽管延長形成菌絲在蟲體表面交織成網(wǎng)絡(luò)狀，最后覆蓋整個蟲體并產(chǎn)生新的分生孢子。本研究中，長孢蠟蚧菌TF-2菌株不同分生孢子濃度處理豌豆蚜6 d后，LC50為3.26×104孢子/mL，最高濃度(1.0×107孢子/mL)侵染成蟲，LT50為2.92 d，致病力隨分生孢子濃度梯度升高而逐漸增強(qiáng)(圖1; 表1)。這一結(jié)果與德黑蘭大學(xué)Safavi室內(nèi)測試蠟蚧輪枝菌V.lecanii商品制劑Vealrtec?對豌豆蚜毒力結(jié)果基本一致，隨分生孢子濃度增加豌豆蚜致死率升高，LC50為5.14×104孢子/mL(Safavi Etal, 2002)。同樣在室內(nèi)條件下，L.attenuatumYZU 151121菌株侵染豌豆蚜6 d，LC50為3.12×106孢子/mL(Wangetal., 2017)，L.longisporumLRC190侵染歐洲赤松蚜Cinarapini成蟲9 d， LC50為1.2×106孢子/mL (Nazemietal., 2014)。L.longisporumLRC190分生孢子最高濃度(1×108孢子/mL)侵染牧草蚜Siphamaydis和麥無網(wǎng)產(chǎn)管蚜Metopolophiumdirhodum， LT50分別為2.9 d和4.4 d (Fadayivataetal., 2014)。以上室內(nèi)毒力試驗結(jié)果均表明，蠟蚧輪枝菌商品制劑Vealrtec?,L.attenuatumYZU 151121和L.longisporumLRC190相比，長孢蠟蚧菌TF-2菌株具有較強(qiáng)的致病力，是一種具有生物防治應(yīng)用潛力的寄生真菌。同時也表明病原微生物毒力的強(qiáng)弱與不同地理位置篩選的菌株、不同寄主的抗病能力以及實驗條件的差異等具有非常密切的關(guān)系(Vuetal., 2007; Mohammedetal., 2018)。

本研究掃描電鏡和體視顯微鏡觀察顯示長孢蠟蚧菌TF-2菌株分生孢子成功侵染豌豆蚜。接種12 h后，附著在豌豆蚜體表上的TF-2菌株孢子全部萌發(fā)(圖3: A)，與之相對應(yīng)接種48 h后豌豆蚜表現(xiàn)出行動遲緩，體色先變淺后發(fā)暗，最后變癟全身布滿白色菌絲形成僵蚜(圖2: C, D, E, F)，說明TF-2菌株對豌豆蚜具有較好的侵染能力。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TF-2菌株分生孢子附著在蟲體表皮形成芽管和附著胞(圖3: A, B, C)，在附著部位呈現(xiàn)凹陷狀，附著胞產(chǎn)生粘液層，粘液層可能是附著胞分泌產(chǎn)生一些分解表皮的水解酶類所致，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶、酯酶和淀粉酶等胞外酶(Bidochka and Khachatourians, 1988; St Legeretal., 1989)，這些酶分解寄主表皮蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，為蟲生真菌生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，說明粘液層中的酶類在表皮營養(yǎng)的獲取中發(fā)揮重要作用。掃描電鏡圖片亦顯示，孢子萌發(fā)形成芽管，但未侵入表皮，而是芽管延長在蟲體復(fù)眼、觸角窩、足基節(jié)、腹生殖節(jié)等薄弱部位表面形成菌絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這一侵染方式與文獻(xiàn)報道(Ghaffarietal., 2017)一致。網(wǎng)絡(luò)狀的菌絲利用蟲體表皮水解產(chǎn)物獲取營養(yǎng)生長，致使寄主死亡變僵，覆蓋在蟲體上的菌絲體產(chǎn)生新的分生孢子(圖3: G, H)。 而菌絲在蟲體表面生長過程中是否產(chǎn)生有毒代謝物質(zhì)誘發(fā)寄主死亡，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果均為在室內(nèi)可控條件下獲得，由毒力實驗結(jié)果證實了長孢蠟蚧菌TF-2菌株對豌豆蚜成蟲的高致病性，基本闡明了設(shè)置條件下侵染豌豆蚜成蟲的形態(tài)學(xué)特征和表觀過程，為新分離得到的昆蟲病原真菌——長孢蠟蚧菌TF-2菌株的后續(xù)開發(fā)利用奠定了必要的理論基礎(chǔ)。但是，在生產(chǎn)實際中，由于生防真菌的田間應(yīng)用會受到溫度和濕度等環(huán)境因素的干擾，使其利用受到一定限制。因此，還需深入剖析其致病機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)利用本菌種進(jìn)行生物防治提供科學(xué)依據(jù)。