樺菌芝多糖抗氧化性及抑菌活性研究

許海燕 彭修娟 王 珊 劉 峰，2 劉艷紅

(1. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

樺菌芝(Phropolyporusfomentarius)又名木蹄、木蹄層孔菌，真菌多孔菌科，褐層孔屬植物木蹄的菌體，寄生于樺樹樹干上，廣泛分布于中國東北、西北、華南等地區(qū)[1]。其性平，味微苦，有良好的消積化癖、抗癌作用，常用于治療小兒食積、胃癌、子宮癌等疾病[2]。樺菌芝中化學(xué)成分多樣，主要包括多糖、三萜類、酚類、蒽醌類、香豆素類、有機(jī)酸等[3]。目前，有關(guān)樺菌芝的研究主要集中于多糖、三萜等化學(xué)成分的提取工藝優(yōu)化及多糖的抗腫瘤、提高免疫力等方面[1,4]，關(guān)于除多糖外的其他活性成分及多糖抗氧化、抗菌作用的研究尚未見報道。

多糖是由多個單糖縮合失水連接而成的高聚物[5]，幾乎存在于所有動植物中。研究[6-7]表明，多糖具有很強(qiáng)的生物活性，可調(diào)控細(xì)胞分裂和分化，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒等藥理活性。多糖的抗氧化作用機(jī)制具有多途徑、多靶點、多效應(yīng)，主要是通過內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路Nrf2-ARE通路，調(diào)節(jié)編碼下游抗氧化酶基因的表達(dá)[8]。這些抗氧化酶能夠阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而減少自由基的生成，消除過多自由基，從根源上防治疾病的產(chǎn)生。抑菌方面，多糖等植物提取物不僅能夠選擇性抑制外源性有害菌的生長，還能通過調(diào)控腸道微生物菌群的組成最終達(dá)到改善腸道功能和提高宿主免疫力的目的[9]。因此，通過研究植物提取物的抗氧化和抑菌作用，可從根源上防治疾病的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)菌群抑制有害菌的生長，在開發(fā)藥品、食品、保健品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

試驗擬以樺菌芝為原料，采用水提取乙醇沉淀法提取分離樺菌芝多糖，分析其清除DPPH自由基和ABTS自由基能力，并用濾紙片法測定不同濃度樺菌芝多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和四聯(lián)球菌的抑菌活性及最低抑菌濃度(MIC)，旨在為樺菌芝活性的進(jìn)一步研究補(bǔ)充資料，也為其多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試藥與試劑

樺菌芝：陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)楊新杰副教授鑒定為多孔菌科樺菌芝的菌體；

DPPH：分析純，北京中生瑞泰科技有限公司；

ABTS：分析純，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；

無水乙醇：分析純，上海紅巖試劑廠；

BHT：分析純，鄭州超群化工食品有限公司；

抗壞血酸(VC)、過硫酸鉀：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

試驗用水均為純化水；

大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草桿菌[CMCC(B)63501]、四聯(lián)球菌[CMCC(B)72743]：中國微生物菌種保藏中心；

青霉素鈉(A090702511)：河北新張藥股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

植物粉碎機(jī)：FZ102型，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；

紫外—可見分光光度儀：UV-1800型，北京萊貝賽威科技有限公司；

電子天平：FA1004B型，蘇州江東精密儀器有限公司；

電動離心機(jī)：80-1型，江蘇中大儀器科技有限公司；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-6型，成都一科儀器設(shè)備有限公司；

超聲波清洗器：KO5200DE型，上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：BPX-82型，上海博迅實業(yè)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樺菌芝多糖的制備 稱取預(yù)處理后的樺菌芝藥材粉末20 g，參照陳勝發(fā)等[10]的方法提取樺菌芝多糖。

1.3.2 抗氧化活性測定

(1) 供試品、對照品的制備：參照文獻(xiàn)[11]的方法并修改。配制2.0 mg/mL的多糖樣品溶液50 mL，再分別稀釋成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mg/mL，待用，同濃度配制BHT和VC對照品溶液，供抗氧化活性測定。

(2) DPPH自由基清除活性的測定：參照文獻(xiàn)[12]的方法并修改。取各濃度樣品液2 mL，加入新配制的穩(wěn)定DPPH自由基溶液(1×10-4mol/L) 2 mL，搖勻，共10組，室溫下避光放置30 min，測定517 nm處吸光度值。以無水乙醇為空白對照，以BHT溶液和VC溶液為陽性對照，并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%

Ai——多糖樣品與DPPH自由基混合溶液吸光度；

Aj——多糖樣品與無水乙醇混合溶液吸光度；

AO——DPPH自由基和無水乙醇混合溶液吸光度。

(3) ABTS自由基清除活性的測定：參照文獻(xiàn)[13]的方法并修改。將ABTS溶液與不同濃度的多糖樣品溶液按體積比19∶1配制成4 mL的混合溶液，搖勻，室溫下避光放置6 min，測定734 nm處吸光度值，以無水乙醇為空白對照，以BHT和VC為陽性對照，并按式(2)計算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%

A1——多糖樣品與ABTS自由基混合溶液吸光度；

A0——多糖樣品與無水乙醇混合溶液吸光度。

1.4 抑菌活性測定

1.4.1 菌種活化 選取大腸桿菌、金黃葡萄球菌、四聯(lián)球菌、枯草桿菌4種菌種，在瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，連續(xù)2～3次。

1.4.2 供試品、對照品的制備 參照文獻(xiàn)[14]的方法并修改。精密稱取適量樺菌芝多糖溶于無菌水，使其濃度為10.0 mg/mL，用于抑菌活性測定；另取適量樺菌芝多糖溶于無菌水，配制成10.0 mg/mL的多糖樣品溶液作為母液，采用連續(xù)稀釋法，配制成5組不同濃度(0.625，1.250，2.500，5.000，10.000 mg/mL)樺菌芝多糖提取物溶液，用于最小抑菌濃度測定。稱取1 g注射用青霉素鈉干粉溶于100 mL氯化鈉注射液中，得到濃度為10 mg/mL注射用青霉素鈉溶液為陽性對照。

1.4.3 抑菌活性的測定 參照文獻(xiàn)[15]的方法并修改。取直徑為7 mm的濾紙片，于不同濃度的多糖溶液及對照品溶液中浸泡2 h，貼于瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。用浸有無菌水的濾紙片作為空白對照，青霉素鈉為陽性藥物對照。每菌種平行3個，測定抑菌圈直徑。

1.4.4 最低抑菌濃度的測定(MIC) 參照延永等[16]的方法并修改。取 10.0 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、100.0 μL菌懸液(105～106 CFU/mL)和2.0 mL不同濃度樺菌芝多糖溶液于錐形瓶中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，測定517 nm處吸光度。吸光度為0的培養(yǎng)基中加入的秦嶺龍膽提取物溶液為最低抑菌濃度(MIC)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，采用鄧肯氏法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化能力

2.1.1 清除DPPH自由基的能力 由圖1可知，樺菌芝多糖對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除作用，當(dāng)濃度為0.2～2.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)濃度為1.2 mg/mL時，樺菌芝多糖對DPPH 自由基的清除率(76%)高于對照品BHT(74%)，但低于對照品VC(79%)；當(dāng)濃度為1.4 mg/mL時，樺菌芝多糖對DPPH自由基的清除率(82%)均高于對照品BHT(76%)和VC(81%)；當(dāng)濃度為1.2～2.0 mg/mL時，樺菌芝多糖對DPPH自由基的清除率均高于對照品BHT及VC，表明樺菌芝多糖的抗氧化效果較好，可以作為植物抗氧劑使用。

圖1 樺菌芝多糖對DPPH自由基清除率的影響

2.1.2 清除ABTS自由基的能力 由圖2可知，當(dāng)濃度為0.2～2.0 mg/mL時，樺菌芝多糖對ABTS自由基的清除能力與溶液濃度呈正相關(guān)。當(dāng)供試品濃度為1.0 mg/mL時，樺菌芝多糖對ABTS自由基的清除率(70%)高于對照品BHT(69%)，且清除率隨多糖濃度的增大而顯著增強(qiáng)(P<0.05)；相同濃度下樺菌芝多糖與對照品BHT、VC間具有顯著性差異(P<0.05)，說明一定濃度范圍內(nèi)的樺菌芝多糖對ABTS自由基有很好的清除作用。

圖2 樺菌芝多糖對ABTS自由基清除率的影響

綜上，樺菌芝多糖對DPPH自由基和ABTS自由基有很好的清除作用，可以直接作用于自由基或間接消耗掉容易生產(chǎn)自由基的物質(zhì)，抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生[17]，起到抗氧化的作用。

2.2 樺菌芝多糖的抑菌能力

2.2.1 對細(xì)菌的抑制效果 由表1可知，樺菌芝多糖對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌具有不同程度的抑制作用，其抑菌效果與對照品青霉素鈉之間無顯著性差異(P>0.05)，但4種指示菌間的抑菌作用具有顯著性差異(P<0.05)。其中，樺菌芝多糖對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌直徑為(12.24±2.16) mm，接近陽性對照青霉素鈉的[(12.36±1.86) mm]，對四聯(lián)球菌的抑制較弱，抑菌直徑為(3.54±0.76) mm。后續(xù)可通過大孔樹脂色譜、凝膠過濾色譜、硅膠柱色譜等分離方法，篩選出抑菌活性成分。

表1 樺菌芝多糖對4種指示菌的抑制效果?

2.2.2 最小抑菌濃度(MIC) 由表2可知，樺菌芝多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和四聯(lián)球菌的MIC值分別為1.250，1.250，2.500，5.000 mg/mL，說明樺菌芝多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，對四聯(lián)球菌的抑菌活性最弱；樺菌芝多糖的抑菌活性隨濃度的增大而增強(qiáng)。后續(xù)可通過一定的分離純化手段，得到準(zhǔn)確的多糖MIC值。

表2 樺菌芝多糖的最小抑菌濃度?

3 結(jié)論

利用水提取乙醇沉淀法對樺菌芝多糖進(jìn)行了提取及初步分離，研究了樺菌芝多糖的抗氧化和抑菌活性。結(jié)果表明，樺菌芝多糖對DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除作用，且其清除能力與多糖濃度呈顯著正相關(guān)，說明多糖是樺菌芝的主要抗氧化活性成分。體外抑菌試驗顯示，樺菌芝多糖對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌具有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。后續(xù)將對樺菌芝多糖進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以得到明確的抗氧化、抑菌活性成分，為樺菌芝多糖的深入研究利用，以及將其開發(fā)成為天然抗氧化劑和抑菌劑方面提供依據(jù)。