赤小豆凝集素的分離純化及電泳分析

肖俊琪 翟愛華,2,3 張東杰,2,3

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319;3. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

赤小豆[Vignaumbellata(Thunb.)Ohwi and Ohashi]是亞洲豇豆屬中的罕見亞種，由于具有豐富的營養(yǎng)價值和獨特的藥用價值在中國被廣泛食用[1]。其蛋白質(zhì)含量為22%，脂肪含量為0.3%，碳水化合物含量為65%[2]，還含有一定的兒茶素、表兒茶素、槲皮素-3’-O-ɑ-L-鼠李糖苷和(±)二氫槲皮素等活性物質(zhì)[3]。赤小豆可用于治療慢性復(fù)發(fā)皮膚炎、小兒急性腎小球腎炎和一些慢性皮膚病[4]，并具有重要的營養(yǎng)調(diào)節(jié)功能[5]和藥用價值[6-7]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的凝集素有57 000余種，其中豆科凝集素有1 600多種，且有近400種凝集素具有3D構(gòu)象[8]。凝集素是一類能結(jié)合糖結(jié)構(gòu)域的非免疫性糖蛋白或碳水化合物結(jié)合蛋白[9]，可用于凝集素—捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(Lectin-Capture ELISA)中快速捕獲和定量樣品中的HCV E1E2抗體[10]；在病原體感染的先天免疫應(yīng)答中起重要作用并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性[11]；凝集素還具有抗生物膜特性和抑菌特性，可成為治療疾病的潛在工具[12]。凝集素由于能特異性識別血細(xì)胞而被應(yīng)用于血型檢測中[13-14]。試驗擬對赤小豆凝集素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以凝集活性為指標(biāo)評價其分離純化效果。通過SDS-PAGE電泳、Q Sepharose XL陰離子交換色譜、Phenyl FF HP疏水層析色譜和Sephadex G-50凝膠過濾色譜技術(shù)進(jìn)行純化，旨在為提高赤小豆種質(zhì)資源優(yōu)勢和豆科凝集素的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

赤小豆：大慶瑞澤豐農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

超微量分光光度計：NanoDrop 2000c型，美國賽默飛世爾公司；

超純水儀器：Thermo Scientific Barnstead GenPure型，美國賽默飛世爾公司；

小型垂直電泳槽：BIO-RAD MINI 4型，美國伯樂Bio-rad公司；

冷凍干燥機(jī)：Alpha 1-2 LD plus型，德國CHRISTA公司；

PBS磷酸鹽緩沖溶液、PB磷酸鹽緩沖液、硫酸銨、氯化鈉：分析純，中國Biosharp公司；

瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠：分析純，瑞典烏普薩拉公司；

交聯(lián)葡聚糖凝膠：分析純，美國通用電氣公司；

電泳試劑：分析純，美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取條件優(yōu)化

(1) 浸提液種類：料液比1∶15 (g/mL)，pH 7.5，提取時間12 h，考察浸提液種類(ddH2O、0.01 mol/L PB、0.01 mol/L Tris-HCl、0.01 mol/L生理鹽水、0.01 mol/L PBS)對凝集活性的影響。

(2) 料液比：以PBS為浸提液，pH 7.5，提取時間12 h，考察料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]對凝集活性的影響。

(3) pH：以PBS為浸提液，料液比1∶20 (g/mL)，提取時間12 h，考察pH (6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)對凝集活性的影響。

(4) 浸提時間：以PBS為浸提液，料液比1∶20 (g/mL)，pH 7.5，考察浸提時間(4，8，12，16，20 h)對凝集活性的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以料液比、pH和提取時間為試驗因素，以凝集活性為響應(yīng)值，運用Design Expert 8.0設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗。

1.2.3 硫酸銨分級沉淀 根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]修改如下：向粗提液中加入飽和硫酸銨溶液，分別調(diào)節(jié)飽和硫酸銨濃度至35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%。4 ℃靜置4 h，11 000 r/min離心10 min，分別收集沉淀和上清液。不同飽和濃度下的沉淀物以ddH2O復(fù)溶，并充分透析(14 kDa，36 mm)，測定復(fù)溶液凝集活性，選取硫酸銨分級沉淀范圍。

1.2.4 凝集活性測定 參照Park等[17]的方法。按式(1) 計算凝集活性。

(1)

式中：

Y——凝集活性，HU；

n——凝集孔的最大數(shù)量；

C——蛋白濃度，mg/mL；

V——樣品體積，μL。

1.2.5 丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]修改如下：凝膠以5 mg/100 mL堆疊在上層，下部凝膠為12 mg/100 mL；起始電壓80 V，保持15 min；分離標(biāo)記后將電壓調(diào)至120 V，連續(xù)運行30 min；用考馬斯亮藍(lán)R-250振蕩染色15 min；使用5 mL/100 mL乙醇和10 mL/100 mL 乙酸混合溶液脫色。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度測定 使用NanoDrop 2000C測定蛋白質(zhì)濃度，PBS溶液為空白組，選取2 μL樣品。

1.2.7 離子交換色譜 緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.8)溶解樣品，用預(yù)平衡的陰離子交換柱Q Sepharose XL(Q XL 1 mL)和緩沖溶液B(1 mol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8) 對蛋白質(zhì)進(jìn)行梯度洗脫(0%～100%)，流速0.5 mL/min，洗脫體積20 mL。收集洗脫組分用于凝血活性檢測和SDS-PAGE分析。

1.2.8 疏水層析色譜 緩沖溶液C(2.4 mol/L (NH4)2SO4+20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8)用于平衡色譜柱Phenyl FF HP(HiTrapTM1 mL)，緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl)梯度洗脫柱上蛋白質(zhì)(0%～100%)，流速0.5 mL/min，洗脫體積20 mL。收集洗脫組分用于凝血活性檢測和聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析。

1.2.9 凝膠過濾色譜 將富集的組分加載到已用緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8)平衡的Sephadex G-50凝膠過濾層析柱上，流速0.5 mL/min。收集洗脫組分用于凝血活性檢測和SDS-PAGE分析。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 運用Origin 8.0、SPSS 19.0、MaxQuant 1.6.1.0、PrimeView 5.0和Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸提液對凝集素提取效果的影響 由圖1可知，生理鹽水組和PBS組的凝集活性明顯高于其他組，其中PBS組的更高，可能與PBS緩沖液具有較強(qiáng)的緩沖作用有關(guān)，能更好地維持凝集素的結(jié)構(gòu)和活性，與蘇艷玲等[20]的研究結(jié)果一致。因此，PBS溶劑為赤小豆凝集素的最優(yōu)提取劑。

圖1 浸提液種類對凝集素提取效果的影響

2.1.2 料液比對凝集素提取效果的影響 由圖2可知，凝集活性隨料液比的增加呈先增加后降低趨勢。隨著料液比的增加，可溶性蛋白傳質(zhì)動力增加，蛋白質(zhì)溶解度增大[21]；當(dāng)可溶性蛋白濃度達(dá)最大值后，料液比的增加反而會使蛋白質(zhì)濃度降低[22]。故選擇料液比為1∶20 (g/mL)進(jìn)行赤小豆凝集素粗提取。

圖2 料液比對凝集素提取效果的影響

2.1.3 pH對凝集素提取效果的影響 凝集素具有兩性解離性質(zhì)，溶液pH與蛋白等電點會影響凝集活性[23]。豆科植物凝集素等電點多為5.4～6.5，當(dāng)提取劑pH接近赤小豆凝集素等電點時，凝集素聚沉凝集活性降低，偏離等電點后凝集素逐漸溶解，凝集活性增大[24]。由圖3可知，當(dāng)pH為 6.0～6.5時，凝集活性較低且變化不明顯，當(dāng)pH值繼續(xù)增大至偏離凝集素等電點時，凝集素逐漸溶解，凝集活性逐漸上升，并在pH 7.5附近達(dá)最大值。因此，選擇pH 7.5作為赤小豆凝集素浸提液的最佳pH值。

圖3 pH對凝集素提取效果的影響

2.1.4 提取時間對凝集素提取效果的影響 由圖4可知，凝集活性隨提取時間的延長呈先上升后下降趨勢，當(dāng)浸提時間為16 h時，凝集活性達(dá)到峰值(35.10 HU)，說明提取時間的適當(dāng)延長有利于赤小豆凝集素的提取。因此，選擇16 h作為赤小豆凝集素提取的最優(yōu)浸提時間。

圖4 浸提時間對凝集素提取效果的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗設(shè)計與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以凝集活性為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，試驗因素水平見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 使用Design Expert 8.0軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得凝集活性(Y)的二次多項式回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

Y=34.91+2.99X1+6.13X2-3.72X3-0.85X1X2+1.51X1X3-6.19X2X3-1.44X12-8.84X22-5.38X32。

(2)

表3 二次模型的方差分析?

2.2.3 交互作用分析與驗證 由圖5可知，料液比與pH之間對凝集活性的影響不顯著、料液比與浸提時間之間對凝集活性的影響顯著、pH與浸提時間之間對凝集活性的影響極顯著，說明各因素間的交互作用極顯著，與方差分析結(jié)果一致。該模型得到的凝集素最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶22.96 (g/mL)，pH 7.76，浸提時間13.77 h，該條件下凝集活性預(yù)測值為38.08 HU。結(jié)合實際，將各因素修正為料液比1∶23 (g/mL)，pH 7.8，浸提時間14 h，實測凝集活性為(37.18±0.18) HU (n=3)，與預(yù)測值接近，表明優(yōu)化的工藝條件可靠，方程擬合良好，具有實際應(yīng)用價值。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面曲面圖

2.3 硫酸銨分級沉淀

由表4可知，當(dāng)混合液中硫酸銨飽和度提高到45%時，開始出現(xiàn)凝集活性(0.06 HU)，且隨混合液中硫酸銨飽和度的增加出現(xiàn)兩個凝集活性增加區(qū)間(45%～65%和70%～85%)，直至混合液中硫酸銨飽和度為85%時達(dá)到最大(178.32 HU)；當(dāng)混合液中硫酸銨飽和度由65%增加至70%時，凝集活性下降(17.44 HU)，說明在此分級區(qū)間內(nèi)有更多雜蛋白被沉淀出來；為保證凝集素含量并減少試劑用量，選擇赤小豆凝集素的硫酸銨分級沉淀范圍為45%～80%。

表4 硫酸銨分級沉淀結(jié)果

2.4 離子交換色譜

由圖6可知，相比于DEAE填料，Q Sepharose XL填料具有更好的分離效果。經(jīng)Q Sepharose XL層析分離出具有凝集活性的組分F1和F2，其中組分F2的凝集活性更高，而F3未觀察到凝集現(xiàn)象。因此，收集組分F1和F2的峰部分，富集后用于疏水層析色譜進(jìn)一步分析。

圖6 離子交換色譜

2.5 疏水層析色譜

由圖7可知，經(jīng)疏水層析梯度洗脫分離出了兩個具有凝集活性的組分F4和F5，其峰型變化趨勢與凝集活性變化趨勢相同，說明組分F4與F5中可能存在兩種具有不同疏水性質(zhì)的凝集素。凝集素種類的多樣性可能是表4 中出現(xiàn)兩個凝集活性增加區(qū)間的原因。對比SDS-PAGE電泳，組分F5中的蛋白組成更為復(fù)雜，因此重復(fù)提取并富集組分F4中的第15管用于進(jìn)一步分析。

圖7 疏水層析色譜

2.6 凝膠過濾色譜

由圖8可知，經(jīng)凝膠過濾色譜分離出了具有高凝集活性(127 HU)的組分F6。目標(biāo)蛋白在SDS-PAGE電泳中顯示2條電泳條帶，分子量在55 kDa和27 kDa附近，與Pradip等[25]的研究結(jié)果相似。SDS-PAGE電泳中，十二烷基硫酸鈉通過斷裂凝集素與其他分子間的非共價鍵使蛋白分子去折疊，強(qiáng)還原劑(巰基乙醇)能通過斷裂半胱氨酸殘基間的二硫鍵(S—S)使凝集素分子解聚成多肽鏈[26]。因此，凝膠過濾色譜的單一峰型表明目標(biāo)蛋白純化水平較高，并且在溶液中以穩(wěn)定的多聚體形式存在[27]；結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳和凝集活性可以說明，純化的蛋白是單體蛋白，在具有強(qiáng)還原劑條件下，蛋白中的二硫鍵斷裂解聚為兩條亞基并且該亞基具有凝集活性。純化結(jié)果表明，赤小豆凝集素的兩條亞基分子量為55 kDa和27 kDa左右。

圖8 凝膠過濾層析色譜

3 結(jié)論

以赤小豆為原料提取凝集素，利用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗得到赤小豆凝集素的最優(yōu)粗提條件為：以PBS磷酸鹽緩沖液為浸提劑，料液比1∶23 (g/mL)，pH 7.8，浸提時間14 h；粗提物經(jīng)65%～80%飽和硫酸銨分級沉淀、Q Sepharose XL陰離子交換層析、phenyl FF HP疏水層析、Sephadex G-50凝膠過濾層析后獲得赤小豆凝集素。其中，Q Sepharose XL陰離子層析填料比DEAE陰離子層析填料更適合赤小豆凝集素的初步分離；聚丙烯酰胺凝膠電泳表明，赤小豆凝集素的兩條亞基分子量分別在55 kDa和27 kDa附近。后續(xù)還需從以下幾個方面開展研究：① 通過液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法對赤小豆凝集素進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；② 探究赤小豆凝集素基礎(chǔ)理化特性，如金屬離子特異性、細(xì)胞凝集特異性和糖特異性等。