污泥堆肥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

李卓瓊， 黃升日， 張皓楠， 李光春， 黃世臣， 王 娟， 樸春香

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

隨著我國經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展，污水排放量不斷增加，產(chǎn)生的污泥量也不斷增多，2014年，我國年產(chǎn)干污泥量為3×106t[1]。污泥處理不當(dāng)，會(huì)造成水體、大氣、土壤等2次污染[2]，而目前污泥處理速度遠(yuǎn)不及污泥產(chǎn)生速度，給我國環(huán)保工作造成了沉重的負(fù)擔(dān)。污泥的處理方法主要有焚燒、衛(wèi)生填埋和堆肥(好氧發(fā)酵法)等3種方法，其中，堆肥因其經(jīng)濟(jì)性、環(huán)境生態(tài)性及其資源再利用性較高，普遍被國內(nèi)外所應(yīng)用[3-4]。堆肥是利用微生物分解原料中的有機(jī)物而達(dá)到處理的目的[5]，因此，了解堆肥化進(jìn)程，不僅要看發(fā)酵溫度、pH值、C/N等參數(shù)，更應(yīng)把堆肥微生物多樣性結(jié)構(gòu)作為焦點(diǎn)。以目前的研究技術(shù)，能夠培養(yǎng)的微生物不到10%[6]，而且不能充分反映環(huán)境中的微生物多樣性，因此，近年來，變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)等分子生物學(xué)方法用于微生物分析的研究較多，在堆肥領(lǐng)域中也得到廣泛應(yīng)用[7-9]。

我國污泥的堆肥化處理尚處于起步階段，雖然化肥具有營養(yǎng)成分含量高, 體積小, 單位面積用量少, 使用廣泛、方便、肥效快等特點(diǎn), 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。但是大量施用化肥, 雖短期內(nèi)一定程度上提高了作物產(chǎn)量, 但長期施用, 其累加效用導(dǎo)致了土壤微生態(tài)環(huán)境惡化, 養(yǎng)分比例失調(diào)，從而造成農(nóng)作物品質(zhì)下降, 進(jìn)一步威脅到食品安全及人體健康。利用自制活性污泥及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的廢棄物如麥糠、玉米稈、雞糞等, 通過活性污泥中有益微生物種群的發(fā)酵作用, 生成大量適合土壤中微生物利用的如低聚糖等有機(jī)質(zhì), 既可以達(dá)到改良土質(zhì)和供給作物營養(yǎng)的目的, 又能減少對(duì)環(huán)境的污染[10]。一些廢棄的城市污泥和廉價(jià)的禽畜糞便對(duì)植物的生長發(fā)育有促進(jìn)作用, 這些基質(zhì)的應(yīng)用可用來培育優(yōu)質(zhì)的苗木[11]。城市污泥是污水處理廠對(duì)污水處理過程中產(chǎn)生的固體或半固體沉淀物質(zhì), 通常包括初沉污泥和剩余污泥。城市污泥的特點(diǎn)是:1)產(chǎn)量大。根據(jù)中國環(huán)保總局提供的數(shù)字, 中國城市污水處理廠含水率97%的污泥產(chǎn)量為7.602～12.07萬m3/d。2)成分復(fù)雜。城市污泥不僅含有大量的有機(jī)質(zhì)和N、P、K等植物營養(yǎng)成份, 而且含有很多的病原微生物, 同時(shí)還含有一定的重金屬和其他有害成份。這些污泥任意堆放和投棄將對(duì)環(huán)境造成新的污染, 如何妥善處置這些污泥已成為全世界共同關(guān)注的問題[12]。

有機(jī)肥施用是我國傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式,有關(guān)有機(jī)肥的研究文獻(xiàn)較多,但對(duì)于有機(jī)肥的研究主要集中在有機(jī)肥在農(nóng)作物的使用技術(shù)和土壤肥力影響等方面,而對(duì)于以不同物料進(jìn)行有機(jī)肥的堆制研究文獻(xiàn)很少[13]。對(duì)污泥堆肥化的研究主要集中于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的試驗(yàn)研究，對(duì)實(shí)際應(yīng)用過程中的效果，特別是對(duì)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析的研究尚不多見。該試驗(yàn)選擇我國某污泥堆肥廠發(fā)酵過程中的污泥為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵各階段的溫度、pH值、C/N等進(jìn)行了測(cè)定，用PCR-DGGE法對(duì)發(fā)酵細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析研究，該研究結(jié)果為評(píng)價(jià)我國城市污泥堆肥技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀提供理論依據(jù)，并為優(yōu)化我國污泥堆肥處理技術(shù)提供更多信息。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來自于我國某污泥堆肥廠的5個(gè)發(fā)酵堆，發(fā)酵原料為城市污泥。把原料及發(fā)酵產(chǎn)品以一定比例進(jìn)行混合，致使發(fā)酵原料水分達(dá)到50%～60%。在發(fā)酵階段，每7 d用鏟車攪拌均勻，以提高堆肥的質(zhì)量和蒸發(fā)水分，并避免形成厭氧條件。該堆肥廠共24個(gè)發(fā)酵槽，該試驗(yàn)分別選擇了發(fā)酵時(shí)間為第11、15、19、23和30 d的5個(gè)發(fā)酵槽進(jìn)行了采樣。采樣方法為：每次進(jìn)行攪拌前，在堆肥體中間形成縱斷面，分別在如圖1所示的A、B、C、D 4點(diǎn)進(jìn)行采樣，供測(cè)含水率、pH值、C/N及DGGE分析等所用。

發(fā)酵槽的結(jié)構(gòu)：寬550 cm，長1 350 cm，深度200 cm(圖1)。底部布置3根排氣管連接于鼓風(fēng)機(jī)，以1.2 m3/h的速度進(jìn)行通氧。

圖1 發(fā)酵槽的結(jié)構(gòu)(縱斷面)及采樣點(diǎn)布點(diǎn)情況

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 溫度的測(cè)定

對(duì)發(fā)酵堆進(jìn)行攪拌前，形成縱斷面，對(duì)如圖1所示的A、B、C、D 4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行溫度測(cè)定。測(cè)定用100 cm長的酒精溫度計(jì)，形成縱斷面后迅速插入溫度計(jì)50 cm深，待溫度計(jì)溫度穩(wěn)定后讀取數(shù)據(jù)并記錄。

1.2.2 含水率的測(cè)定

用國家標(biāo)準(zhǔn)法：稱取30 g堆肥樣品，在105 ℃烘箱內(nèi)將樣品烘24 h至恒重，然后測(cè)定烘干樣品，記作樣品的干重。

土壤含水量=(烘干前鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量)/(烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干空鋁盒質(zhì)量)×100%。

1.2.3 pH值的測(cè)定

稱取10 g堆肥樣品，放入三角瓶中加蒸餾水50 mL，振蕩30 min，放置5 min，待溶液澄清后，用酸度計(jì)測(cè)定。

1.2.4 C/N(碳氮比)的測(cè)定

C/N用儀器(CN coder MT-700，yanaco，Tokyo，Japan)測(cè)定。

1.2.5 樣品總DNA提取

樣品的DNA抽出采用土壤DNA抽出專用試劑盒(ISOIL：Nippon Gene，Tokyo，Japan)。稱取0.5 g樣品放入2 mL滅菌離心管中，加入950 μL Lysis solution HE和Lysis solution 20S 50 μL，混合均勻后，在65 ℃下水浴60 min，10 000 r/min室溫離心1 min。移取上清液600 μL于另一1.5 mL離心管中，加入400 μL Purification solution，混合，再加入600 μL氯仿后充分振蕩混勻，10 000 r/min室溫離心15 min。取水層800 μL，再次加入800 μL Purification solution，混合，15 000 r/min 4 ℃離心15 min。棄上清，在沉淀中加入1 mL Wash solution，充分混勻，15 000 r/min 4 ℃離心10 min。棄上清，在沉淀中加入1 mL70%乙醇和2 μL Ethachinmate，振蕩混勻，15 000 r/min 4 ℃離心5 min。棄上清，倒置于吸水紙上空氣干燥10～15 min，使乙醇揮發(fā)。加入100 μL TE(8.0)或dd H2O 溶解DNA，混勻后置于4 ℃待用或-20 ℃冰箱中保存。

1.2.6 PCR擴(kuò)增

PCR引物序列如下：357F-GC，5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TACGGG AGG CAG CAG-3'；907R，5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3'。PCR用TaKaRa Bio，Ohtsu，Japan。

反應(yīng)程序：94 ℃,10 min，1個(gè)循環(huán)；93 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；65 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃，1 min，10個(gè)循環(huán)；93 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；60 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃，1 min，10個(gè)循環(huán)；93 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；55 ℃，30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃，1 min，10個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)。

反應(yīng)體系：由 1 μL16S rDNA，2 μL dNTP混合物，19.8 μL 10×擴(kuò)增緩沖液，0.2 μLTaq DNA聚合酶和2 μL底漆組成，共25 μL。

在進(jìn)行DGGE之前，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7 PCR-DGGE法

PCR-DGGE分析用 DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)。變性梯度凝膠厚1 mm，大小160×160 mm，緩沖液使用1×TAE。聚丙烯酰胺凝膠濃度梯度為8%～12%，變性劑濃度梯度30%～70%。電泳電壓100 V，60 ℃條件下進(jìn)行850 min。電泳后用SYBR Green I(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色 30 min，清洗后在凝膠呈像儀下呈像。

1.2.8 基因序列分析

在紫外燈下用1 000 μL移液槍把凝膠吸回，獲得DGGE條帶，放置在50 μL蒸餾水中。切下來的條帶中的DNA用357F-GC和 907R引物重新擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物再用DGGE法確定原始條帶的位置。這些步驟重復(fù)進(jìn)行，直至唯一1條單帶出現(xiàn)。之后用Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，并送往生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用DNA數(shù)據(jù)庫提供的DDBJ-BLAS(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度、水分含量、pH值和C/N的變化

表1～4各表示發(fā)酵第11、15、19、23和30 d發(fā)酵槽中A、B、C、D 4個(gè)點(diǎn)的溫度、水分含量、pH值和C/N的測(cè)定結(jié)果。

表1 堆肥過程中發(fā)酵溫度的變化

發(fā)酵溫度在一定程度上反映發(fā)酵的進(jìn)程及發(fā)酵效果的好壞，實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)酵溫度最高80 ℃，最低28 ℃，20個(gè)采樣點(diǎn)中，除了2個(gè)溫度最高點(diǎn)和最低點(diǎn)之外，均在30～50 ℃之間?？傮w上，發(fā)酵溫度比采樣時(shí)室溫(28 ℃)偏高，說明該堆肥發(fā)酵正常進(jìn)行，但發(fā)酵溫度跟理想值(50 ℃左右)相比偏低(50 ℃)，不到40 ℃的點(diǎn)數(shù)為13個(gè)，超過50 ℃的只有1個(gè)點(diǎn)，發(fā)酵溫度低會(huì)影響發(fā)酵速度及水分蒸發(fā)，也不利于殺死病原菌。A、B、C、D 4個(gè)點(diǎn)中，B點(diǎn)溫度相對(duì)最高，其次為D點(diǎn)和A點(diǎn)，C點(diǎn)最低。這可能與離排氣管的距離有關(guān)，C點(diǎn)離排氣管最近，雖然增大與氧氣接觸面積，但由于冷空氣的干擾導(dǎo)致溫度最低，A點(diǎn)雖然離排氣管最遠(yuǎn)，但因離外部環(huán)境距離近，損失熱量相對(duì)多，溫度也不高，而B點(diǎn)和D點(diǎn)處于發(fā)酵體中間位置，而D點(diǎn)比B點(diǎn)離排氣管更近，受供氣影響更大，因此,B點(diǎn)溫度最高。發(fā)酵第15天發(fā)酵堆的條帶數(shù)相對(duì)少于其他點(diǎn)，這可能與該發(fā)酵堆發(fā)酵溫度高于其他發(fā)酵堆有關(guān)(B點(diǎn)80 ℃)，高溫環(huán)境下微生物不易生存，在B點(diǎn)只有1個(gè)明顯條帶和3個(gè)不明顯條帶。但發(fā)酵第15天發(fā)酵堆中，除了B點(diǎn)外，其他3個(gè)點(diǎn)的高亮度的條帶相對(duì)多，表明該發(fā)酵堆優(yōu)勢(shì)菌種種類豐富，有利于發(fā)酵的進(jìn)行，有一部分菌種可能來自于原料。

表2顯示堆肥水分含量的變化，5個(gè)發(fā)酵堆水分含量在35.5%～54.9%之間，發(fā)酵堆之間差距大，不同發(fā)酵堆同一個(gè)采樣點(diǎn)之間最大差距17.5%，同一個(gè)發(fā)酵堆不同采樣點(diǎn)之間差距小，最大3.7%。總體上，5個(gè)發(fā)酵堆水分含量均在好氧發(fā)酵允許范圍之內(nèi)，但發(fā)酵堆之間水分含量差距較大，且發(fā)酵末期水分含量偏高，這不利于再加工和搬運(yùn)。

表2 堆肥過程中水分含量的變化

污泥堆肥過程中容易產(chǎn)生有機(jī)酸，致使pH值下降[10]，導(dǎo)致反應(yīng)速度減慢甚至停止，該次調(diào)查中，pH值在7.2～8.3之間(表3)，基本處于好氧發(fā)酵最佳pH值范圍(6.5～8.0)內(nèi)[14]。

表3 堆肥過程中pH值的變化

堆肥中的碳和氮為微生物提供能量和細(xì)胞構(gòu)成基本材料[14]。由表4可知，C/N為8.52～11.13時(shí)，發(fā)酵堆之間和各采樣點(diǎn)之間差距小。因發(fā)酵堆不同，原料也不同，因此，未能觀察到C/N隨時(shí)間推移的變化規(guī)律。

表4 堆肥過程中碳氮比(C/N)的變化

2.2 PCR-DGGE分析結(jié)果

對(duì)5個(gè)發(fā)酵堆20個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)采樣，提取了DNA，并用DGGE法針對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因片段進(jìn)行分類鑒定。5個(gè)發(fā)酵堆的菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)了基本相同的電泳圖譜，從條帶位置、個(gè)數(shù)、亮度等方面均類似(圖2)。5個(gè)發(fā)酵堆原料進(jìn)廠時(shí)間不同，來源和成分也不盡相同，但發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)相似，說明該廠發(fā)酵菌群非常穩(wěn)定，其中理由之一為該廠把發(fā)酵最終產(chǎn)物作為水分調(diào)節(jié)劑與原料進(jìn)行混合并發(fā)酵，最終產(chǎn)物里含有大量發(fā)酵菌群，再次發(fā)酵時(shí)可以繼續(xù)發(fā)揮分解作用，起到了添加菌劑的作用。

圖2 DGGE分析結(jié)果

其中a、as、av、aw在不同堆肥堆的不同點(diǎn)均能發(fā)現(xiàn)，可能是該堆肥廠的優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)好氧發(fā)酵起重要作用，j和k在較高溫度下表現(xiàn)更亮，表明可能在中高溫區(qū)主要由這2種菌種起主要作用。發(fā)酵第15天發(fā)酵堆的條帶數(shù)相對(duì)少于其他點(diǎn)，這可能與該發(fā)酵堆發(fā)酵溫度高于其他發(fā)酵堆有關(guān)(B點(diǎn)80 ℃)，高溫環(huán)境下微生物不易生存，在B點(diǎn)只有1個(gè)明顯條帶和3個(gè)不明顯條帶。但發(fā)酵第15天發(fā)酵堆中，除了B點(diǎn)外，其他3個(gè)點(diǎn)的高亮度條帶相對(duì)多，表明該發(fā)酵堆優(yōu)勢(shì)菌種種類豐富，有利于發(fā)酵的進(jìn)行，有一部分菌種可能來自于原料。這次分析中未能觀察到微生物菌群隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)，這可能與試驗(yàn)選擇了不同的發(fā)酵堆有關(guān)，因5個(gè)發(fā)酵堆起始點(diǎn)的原料、水分、pH值，C/N等均不相同，發(fā)酵進(jìn)程也不同，將會(huì)導(dǎo)致參加發(fā)酵的微生物菌群也不同(表5)。

表5 菌種類似性分析對(duì)比表

這次PCR-DGGE分析中共鑒定出3個(gè)門(Bacteroidetes,Firmicutes和Actinobacteria)3個(gè)目(Sphingobacteriales，Bacillales和不明目)的7種菌和不確定菌種5種。a點(diǎn)菌種與SphingobacteriaceaebacteriumGsoil524(EU370954)相似度達(dá)99%，SphingobacteriaceaebacteriumGsoil524發(fā)現(xiàn)于人參養(yǎng)殖地的土壤中，屬于好氧細(xì)菌[15]。Bacillales目是各種好養(yǎng)發(fā)酵過程中最常出現(xiàn)的菌屬之一，在發(fā)酵初期和高溫期最容易出現(xiàn)，是典型好養(yǎng)細(xì)菌。Actinobacteria門經(jīng)常出現(xiàn)在土壤、好氧堆肥中，大部分為好氣性。不確定所屬的6個(gè)菌種中3種曾在其他堆肥中發(fā)現(xiàn)，其他3種為難培養(yǎng)微生物。j和k屬于Bacillales目，很可能屬于好熱性細(xì)菌，屬高溫細(xì)菌。總體上，該堆肥廠優(yōu)勢(shì)菌種主要為芽胞桿菌屬，這與其他好氧發(fā)酵的分析結(jié)果相同。

3 結(jié)論與討論

雖然我國堆肥歷史較長，但因?qū)Χ逊实闹匾暢潭炔粔?，發(fā)展較慢，因此對(duì)堆肥的基礎(chǔ)研究不夠深入，對(duì)堆肥的微生物研究近幾年才開始逐漸活躍起來，只有了解微生物菌群多樣性、優(yōu)勢(shì)菌種、動(dòng)態(tài)等，才能更深入了解其發(fā)酵機(jī)理，并能更好的控制其他條件而提高效率，改善發(fā)酵技術(shù)。

該研究選擇了我國某新建堆肥廠發(fā)酵過程中的污泥為對(duì)象，了解了發(fā)酵基本情況，用PCR-DGGE法進(jìn)行了微生物群落結(jié)構(gòu)分析。該堆肥廠好氧發(fā)酵基本良好，但也存在發(fā)酵溫度偏低、水分偏高等問題，可通過控制初始原料的條件和加強(qiáng)發(fā)酵過程管理提高發(fā)酵效率。微生物群落分析中，共鑒定出Bacteroidetes,Firmicutes和Actinobacteria3個(gè)門的7種菌和不確定菌種5種，推斷Bacillales目是該堆肥廠優(yōu)勢(shì)菌種。但PCR-DGGE法有條帶共遷移等缺陷，不能以此結(jié)果完全了解堆肥情況，可以結(jié)合培養(yǎng)法和其他分子生物學(xué)方法提高客觀準(zhǔn)確性。在該試驗(yàn)中，因客觀原因，沒有對(duì)發(fā)酵初期(1～10 d)的樣品進(jìn)行分析，因此沒能觀察到發(fā)酵溫度、水分、C/N以及微生物菌群隨發(fā)酵時(shí)間而變化的過程，近期將繼續(xù)對(duì)該部分進(jìn)行研究。