2種培養(yǎng)方式下人參不定根生長動態(tài)觀察及活性物質含量測定

郝悅君, 孫浩丁, 車成來, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科人參屬多年生草本藥用植物，因其全貌似人形而得名，被譽為“百草之王”[1]。人參在中國、朝鮮、韓國、俄羅斯等地區(qū)均有分布，在我國主要產(chǎn)于吉林省長白山地區(qū)一帶[2]。作為馳名中外的名貴藥材，人參中富含多種活性物質，如皂苷、多糖、黃酮、維生素和礦物質等，具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、增強免疫力、抗腫瘤等藥理活性[3-5]。目前市場上人參的來源主要是采挖野生資源和人工栽培種植2種方式，但近年來由于人們的過度采挖使得野生人參數(shù)量日益減少。而由于人參栽培過程中的連作障礙未被解決，加之藥材采收期較長，管理成本較高，限制了人參種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。

通過植物組織培養(yǎng)技術在短期內(nèi)獲得植物材料，已成為一種可替代植物資源傳統(tǒng)生產(chǎn)的有效途徑之一[7]。利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織是植物組織培養(yǎng)中最基礎的方法，即通過添加凝固劑使配置好的營養(yǎng)液形成固體狀態(tài)供植物生長，但這種方法卻無法進行大規(guī)模生產(chǎn)，具有一定的局限性。而生物反應器作為一種可實現(xiàn)植物材料大規(guī)模生產(chǎn)的核心設備，具有快速高效、自動化程度高、工作體積大等優(yōu)點，通過讓植物表面與液體培養(yǎng)基充分接觸，提供給植物最佳的生長環(huán)境從而可以提高植物體內(nèi)活性物質含量[8]。據(jù)報道，利用生物反應器培養(yǎng)的高山紅景天[9]、東北刺人參[10]、鐵皮石斛[11]、白色紫錐菊[12]等植物中有效活性成分含量高于其他擴繁技術手段。目前，樸炫春等[13]人已建立了人參不定根生物反應器培養(yǎng)體系，但對培養(yǎng)過程中不定根形態(tài)變化方面的研究未見報道，人參不定根生長動態(tài)研究仍處于空白階段。因此，為進一步探究不同培養(yǎng)模式對人參不定根生長的影響，了解培養(yǎng)過程中人參不定根的形態(tài)變化，該試驗對不同時期生物反應器和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的人參不定根進行了觀察，對不定根生長指標(根長、根數(shù)、根粗)進行測定，為進一步完善人參不定根培養(yǎng)體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

改良樸炫春等[14]的方法培養(yǎng)人參不定根。將液體培養(yǎng)基中收獲的不定根作為試驗材料。

1.2 方法

1)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)：將人參不定根切成大小約1 cm的小段后，接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)基為3/4 MS+5 mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.1 g/L肌醇+50 g/L蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH值調節(jié)至5.8，暗培養(yǎng)下每隔2 d在解剖鏡下拍照后測定不定根根長、根粗及根數(shù)，計算相對生長速率。

2)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)：將人參不定根切成大小約1 cm的小段后，接種于含有2 L培養(yǎng)基的3 L氣升式反應器中。培養(yǎng)基為3/4 MS+5 mg/L IBA+0.1 g/L肌醇+50 g/L蔗糖，pH值調節(jié)至5.8。反應器中人參不定根的接種量為5 g/L(鮮重)，通氣量為300 mL/min。暗培養(yǎng)下每隔5 d進行取樣，在解剖鏡下拍照后測定不定根根長、根粗及根數(shù)，計算相對生長速率。

參照馬丹丹[14]的方法計算相對生長速率，即

R =(lnQ2-lnQ1)/(t2-t1)

式中，Q1為時間t1時調查的不定根根長、根粗、根數(shù)的調查值，Q2為時間t2時不定根根長、根粗、根數(shù)的調查值。

1.3 測定方法

1.3.1 不定根中鮮重、干重的測定

收集反應器和培養(yǎng)皿中培養(yǎng)40 d的不定根，用流水清洗不定根以去除表面培養(yǎng)基，置于脫水機中1 min后稱重，記為鮮物重。將不定根置于45 ℃的烘干箱(YHW-1103遠紅外鼓風干燥箱,天津市華北實驗儀器有限公司,中國)干燥，烘至恒重后測其干物重。

1.3.2 不定根根長、根數(shù)和根粗的測定

對接種于固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿)和液體培養(yǎng)基(生物反應器)中的人參不定根分別進行每2天1次和每5天1次的觀察，拍照記錄動態(tài)培養(yǎng)下不同培養(yǎng)模式中人參不定根的生長狀態(tài)變化。利用ImageJ軟件對不定根的根長、根粗、根數(shù)進行統(tǒng)計。

1.3.3 不定根中總黃酮含量的測定

改良Chang[15]的方法進行總黃酮含量測定。稱取不定根干品粉末0.1 g于離心管中，加入10 mL 75%的乙醇溶液，60 ℃水浴加熱3 h。完成加熱后，過濾，棄濾渣，保留濾液。用75%乙醇溶液將濾液定容至25 mL，為樣品待測液。以濃度為40 μg/mL蘆丁為標準品溶液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL蘆丁標準液以及1 mL樣品待測液加75%乙醇溶液于試管中定容至2.0 mL。向每根試管中加入5% 的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min后加入 10% 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，繼續(xù)進行充分搖勻6 min，最后加入 4% 的NaOH溶液2.0 mL。用紫外分光光度計(UV1102紫外分光光度計，上海天美科學儀器有限公司，中國)在510 nm下測定吸光值，繪制標準曲線，計算出樣品待測溶液濃度。總黃酮含量按下述公示計算：

總黃酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中，C為待測樣品溶液濃度，V為待測樣品溶液體積，D為稀釋倍數(shù),m為不定根質量。

1.3.4 不定根中總酚含量的測定

改良葛曉虹[16]的方法對總酚含量進行測定。稱取不定根干品粉末0.1 g于離心管中，加入10 mL的80%甲醇溶液，80 ℃水浴加熱2 h。完成加熱后，過濾，棄濾渣，保留濾液。用80%甲醇溶液將濾液定容至25 mL，為樣品待測液。以濃度為100 μg/mL沒食子酸為標準品溶液。吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標準品溶液和1 mL樣品待測液于試管中，用80%甲醇溶液定容至2 mL，分別向試管中加入0.1 mL福林-酚試劑，搖勻之后靜置6 min，加入0.5 mL 2%的Na2CO3溶液，暗處靜置1 h后在760 nm 處測定吸光值，繪制標準曲線，計算出樣品待測溶液濃度。總酚含量按下列公式計算：

總酚含量/mg·g-1=CVD/m

式中，C為待測樣品溶液濃度，V為待測樣品溶液體積，D為稀釋倍數(shù)，m為不定根質量。

1.3.5 不定根中總皂苷含量的測定

參照陳蕾等[17]的方法測定人參不定根中總皂苷含量。稱取1 g人參不定根干品粉末，加入25 mL 80%甲醇溶液，80 ℃恒溫水浴2 h，重復2次，離心后取上清，合并2次上清液，80%甲醇溶液定容至100 mL后減壓濃縮至5 mL膏狀物，再使用蒸餾水定容至50 mL，加入25 mL乙醚萃取2次，棄上層，下層加入20 mL水飽和正丁醇溶液繼續(xù)萃取保留上層，下層繼續(xù)萃取，萃取3次，將3次上層液體合并后減壓濃縮，加入甲醇溶液定容至10 mL，即為樣品待測液。吸取樣品待測液10 μL，加入0.5 mL 8%香草醛溶液，搖勻后，加入72%硫酸溶液5 mL，60 ℃水浴加熱10 min后，冰水浴10 min冷卻，將試管振蕩混勻，利用分光光度計在544 nm處測定吸光值。以人參皂苷Re為標準品，取1 mg標準品，用1 mL色譜甲醇溶解后，按上述操作，測量OD值，總皂苷含量按下式計算：

總皂苷含量/mg·g-1=(R1×C/R2)×D

式中：R1為樣品的吸光值，C為標準品的濃度，R2為標準品的吸光值，D為樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗處理均采用3次重復，通過Image J軟件來對根長根粗以及根數(shù)進行測量，試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 人參不定根的生長動態(tài)觀察結果

2.1.1 人參不定根誘導及生長的形態(tài)變化

人參不定根在固體培養(yǎng)基生長的動態(tài)變化如圖1所示。人參不定根在培養(yǎng)初期變化并不明顯，培養(yǎng)至第10天時，不定根慢慢開始膨大，第16天時，不定根分化出側根，并隨著培養(yǎng)時間的延長，分化的側根數(shù)越來越多，長度越來越長。但培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)，由于側根的長度和數(shù)量不斷增多，難以清晰地捕捉單個不定根圖像，故該試驗中僅對固體培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d之內(nèi)的形態(tài)圖像進行捕捉。

圖1 人參不定根在固體培養(yǎng)基中生長動態(tài)

由圖2可知，液體培養(yǎng)基中的人參不定根生長狀況良好。培養(yǎng)初期不定根形態(tài)無明顯變化，培養(yǎng)至第10天時，不定根開始膨大，第15 天后開始分化出小側根，并隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，側根數(shù)和長度也不斷增加。

圖2 人參不定根在液體培養(yǎng)基中生長動態(tài)

2.1.2 不定根根長、根粗及根數(shù)隨培養(yǎng)時間的變化

人參不定根根長、根粗以及根數(shù)隨培養(yǎng)時間的變化趨勢見圖3。在固體培養(yǎng)基中，人參不定根分生出的側根根長、根粗及根數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(圖3A～C),培養(yǎng)至40 d時，不定根根長為10.14 mm，根粗為0.74 mm，根數(shù)為52個。而在液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的增加，人參不定根的根長呈現(xiàn)上升的趨勢，根粗和根數(shù)呈現(xiàn)出先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(圖3D～F)，在20～25 d時，不定根根長和根數(shù)急劇上升，但培養(yǎng)至35 d后，根粗和根數(shù)無明顯變化。培養(yǎng)至40 d時，不定根根長為12.45 mm，根粗為0.72 mm，根數(shù)為25個。

注：A、B、C分別是固體培養(yǎng)基中根長、根粗和根數(shù)的變化;D、E、F分別是液體培養(yǎng)基中根長、根粗和根數(shù)的變化

2.1.3 不同培養(yǎng)時間不定根相對生長速率的變化

調查人參不定根的相對生長速率時發(fā)現(xiàn)，在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)初期(0～18 d)和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)初期(0～20 d)時，人參不定根并未分生出側根。因此，該研究僅對固體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 d后和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后的人參不定根各項目的相對生長速率進行了統(tǒng)計。結果表明：固體培養(yǎng)基中人參不定根分生出的根長、根粗以及在培養(yǎng)的第18～24天時，生長速率最快，之后各項目的生長速率均有所降低(表1)，這可能是由于后期培養(yǎng)基中的養(yǎng)分消耗過多導致的。而在液體培養(yǎng)基中，人參不定根的根長、根粗以及根數(shù)在第20～25天達到最大值，生長較為活躍，并且根長的生長速率是固體培養(yǎng)基中不定根根長生長速率的2.44倍(表2)。

表1 人參不定根在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的相對生長速率

表2 人參不定根在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時的相對生長速率

2.1.4 人參不定根中生物量及有效成分的測定

對于培養(yǎng)40 d后的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中人參不定根的生物量和有效成分進行測定(表3)，以單位體積培養(yǎng)基(L)培養(yǎng)獲得的人參不定根的鮮重和干重為生物量評價指標。結果表明：在固體培養(yǎng)基中人參不定根的鮮重和干重僅為10.38和1.37 g/L，而液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的人參不定根的鮮重為91.86 g/L，干重為10.73 g/L，優(yōu)于固體培養(yǎng)模式。2種培養(yǎng)模式下培養(yǎng)的人參不定根有效物質含量無明顯差異，在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的人參不定根中總黃酮含量為1.31 mg/g，總酚含量為3.92 mg/g，總皂苷含量為5.82 mg/g。

表3 固體和液體培養(yǎng)基中人參不定根中生物量及有效成分含量的比較

3 討論與結論

人參喜陰涼，多生長于林地，對栽培環(huán)境的要求十分嚴格，但傳統(tǒng)的“伐林栽參”種植模式已不符合目前我國的林地保護政策，使得人參資源的大規(guī)模開發(fā)受到了限制[18-19]。與傳統(tǒng)藥用植物栽植方式相比，藥用植物組織培養(yǎng)技術為藥用植物的開發(fā)與利用提供了更大的空間，它不受時間和地理位置的拘束，可在短期內(nèi)獲得所需植物材料[20]。但在植物組織培養(yǎng)的過程中，相同的培養(yǎng)基配方，不同狀態(tài)的培養(yǎng)條件，對植物生長狀態(tài)也會造成一定的影響。彭菲等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃花石蒜不定根在液體培養(yǎng)下的生根數(shù)量和根的增殖倍數(shù)均高于固體培養(yǎng)。施和平等[22]發(fā)現(xiàn)，與固體培養(yǎng)的毛狀根相比，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根生長更加迅速，且三裂葉野葛毛狀根中的細胞內(nèi)活性氧含量、生物量以及可溶性總糖含量都顯著高于固體培養(yǎng)的毛狀根。這均與該試驗的研究結果一致。該試驗研究表明：不同培養(yǎng)模式下人參不定根的根長、根粗及根數(shù)均隨著培養(yǎng)時間增加而增加，但不同模式下的根長、根粗、根數(shù)的生長速率有所不同。與固體培養(yǎng)模式相比，液體培養(yǎng)模式更有利于人參不定根生物量的積累，這可能是由于在液體培養(yǎng)模式中人參不定根能夠和培養(yǎng)基溶液充分接觸，更好地吸收養(yǎng)分，促進不定根的生長。該試驗利用生物反應器培養(yǎng)40 d后的人參不定根鮮物重達到91.86 g/L，干物重為10.73 g/L，且不定根中總黃酮含量為1.31 mg/g，總酚含量為3.92 mg/g，總皂苷含量為5.82 mg/g，此結果可為今后更加深入研究人參不定根的生長發(fā)育規(guī)律和其擴大化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。