桔梗提取液經(jīng)微生物發(fā)酵后抗氧化能力研究

曾 玲， 劉金熙， 朱 爽， 張恩瑋， 金 清

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 吉林 133002)

桔梗為桔?？平酃僦参?，拉丁學(xué)名為Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.,藥用其根[1]，含有多種有益人體的活性成分，臨床應(yīng)用價(jià)值高、研發(fā)潛力大[2-3]。在民間被叫做鈴鐺花、包袱花、土人參等，為多年生草本植物[4]。在韓國(guó)、朝鮮被稱為Doraji，在日本叫Kikyo[5]。桔梗在中國(guó)東北、日韓等東亞國(guó)家均有分布，因?yàn)槠涓缓瑺I(yíng)養(yǎng)，又是一種傳統(tǒng)的中草藥，所以常被鮮用或制成咸菜，是良好的功能性食品之一[6]。用桔梗腌制成的咸菜，是我國(guó)延邊朝鮮族人民的傳統(tǒng)食品之一，其口感香辣脆爽，酸甜可口，風(fēng)味獨(dú)特，老少皆宜。另外，桔梗因?yàn)楦缓喾N營(yíng)養(yǎng)成分，也被加工制作成糕點(diǎn)，飲品等[7]。

目前在波蘭桔梗中檢測(cè)出12種酚酸類及其衍生物[8]，用石油醚提取韓國(guó)桔梗的根部，分離出棕櫚酸和油酸2種酚類化合物[9]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，從桔梗中分離出的總黃酮含量大于2.87%[10-11]。由于桔梗富含黃酮類、多酚類等抗氧化活性成分，使其具有抗氧化能力[12]。在微生物發(fā)酵的過(guò)程中，菌種代謝產(chǎn)生的某些酶類會(huì)對(duì)桔梗中的酚類、黃酮類、多糖類物質(zhì)產(chǎn)生影響[13]，使大分子葡萄糖苷類化合物轉(zhuǎn)化為小分子苷元，從而提高枯梗中原有的抗氧化活性成分，增強(qiáng)抗氧化能力。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)菌株能夠較好的轉(zhuǎn)化姜黃素，合成六氫姜黃素與四氫姜黃素。Natio等[14]實(shí)驗(yàn)證明了四氫姜黃素的抗氧化能力大于六氫姜黃素大于姜黃素。Gilberto V M等[15]也發(fā)現(xiàn)可可豆經(jīng)庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌株LPB06和LPB07發(fā)酵后，具有更好的色澤與更豐富的香氣組成，可用于可可豆的風(fēng)味調(diào)節(jié)。

因此，該菌株在通過(guò)天然發(fā)酵提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味及益生菌發(fā)酵罐的研發(fā)制備方面前景廣泛[16]，且2株菌株均能夠在人類胃腸道環(huán)境下生存，可直接在宿主體內(nèi)發(fā)揮其益生功效。目前尚未報(bào)到過(guò)該菌株對(duì)人體有致病性，故可用于微生物發(fā)酵。但在桔梗提取液經(jīng)微生物發(fā)酵后抗氧化能力研究方面，該試驗(yàn)所用菌種研究甚少。人們都希望通過(guò)攝入高品質(zhì)食品，增強(qiáng)體質(zhì)、減少疾病，桔梗作為藥食同源的植物，具有抗菌、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗氧化等多種保健作用[17-18]，但目前這一寶貴資源尚未得到廣泛利用，且桔梗經(jīng)提取后其提取液中的總黃酮、總酚含量會(huì)有所降低，從而導(dǎo)致其對(duì)DPPH·和羥基自由基的清除能力變差，抗氧化能力不顯著。因此，該試驗(yàn)以桔梗為原料制備桔梗提取液，往提取液中接種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)進(jìn)行微生物發(fā)酵，通過(guò)分析望進(jìn)一步提高其抗氧化能力，為桔梗資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)菌株由本實(shí)驗(yàn)室篩選；桔梗片(河北全泰藥業(yè)有限公司提供)。

Tris-HCl 緩沖液、鄰苯三酚、抗壞血酸(Vc)(北京索萊寶科技有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH(上海源葉生物科技有限公司)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海麥克林生化科技有限公司)；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(貨號(hào):A015，南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器與設(shè)備

Z400K型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hermle公司)；FA1104型電子分析天平(上海天平儀器有限公司)；U3900型紫外-可見光分光光度計(jì)(日本日立公司)；HH.S型恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療機(jī)械廠)；ZWY-100H/240型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 桔梗原料的預(yù)處理

將桔梗片用粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)40目篩制成粉末。往50 mL離心管中加入2.5 g桔梗粉末與30 mL蒸餾水，輕輕搖動(dòng)混勻后放入恒溫振蕩器，110 r/min、50 ℃下振蕩提取6 h后取出，在4 000 r/min下離心20 min，取出上清液，并往沉淀物中加入20 mL蒸餾水按上述步驟重復(fù)提取、離心，將2次上清液合并過(guò)濾后，于121 ℃下滅菌15 min，作為原始提取液。由于第2次重復(fù)制取上清液需再振蕩提取6 h，故第1次上清液需先于4 ℃下保存。

按2%的接種量向原始提取液中接種貝萊斯芽孢桿菌與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌株，分別編號(hào)為發(fā)酵組1、發(fā)酵組2，未發(fā)酵組加入等量無(wú)菌蒸餾水作為提取液，30 ℃下恒溫培養(yǎng)72 h后，將發(fā)酵液與提取液在4 000 r/min下離心10 min，分別取上清液置于50 mL容量瓶中并用無(wú)菌蒸餾水定容，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

精密稱取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶液溶解并定容在25 mL容量瓶中，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于試管中，不足部分用70%的乙醇溶液定容至2 mL，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min后再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻、靜置6 min，最終加4%的NaOH溶液2 mL，搖勻、靜置10 min后，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。

含量的測(cè)定及計(jì)算：將待測(cè)樣品溶液用蒸餾水稀釋4倍后，移取1 mL，加入70%的乙醇溶液1 mL，再按照上述步驟測(cè)定其吸光度，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總黃酮濃度，并由以下公式計(jì)算出樣品中的總黃酮含量。

總黃酮含量/mg·mL-1=(X·V·N)/V0

(1)

式中，X-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的總黃酮濃度(mg/mL)；V-待測(cè)樣品溶液定容總體積(mL)；N-稀釋倍數(shù)；V0-待測(cè)樣品溶液測(cè)定吸光度所用體積(mL)。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定

精確稱取5 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解并定容在50 mL容量瓶中，配置成0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，并加入蒸餾水定容，配成0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的系列沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別從上述系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取1.0 mL于試管中，分別加入5 mL蒸餾水、1 mL福林酚試劑、3 mL Na2CO3溶液(7.5 g/100 mL)，振蕩顯色1 h后，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20-21]。

含量的測(cè)定及計(jì)算：用蒸餾水將待測(cè)樣品溶液稀釋5倍，取1.0 mL于試管中，再按照上述制備標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總酚濃度，并由以下公式計(jì)算出樣品中的總酚含量。

總酚含量/mg·mL-1=(X·V·N)/V0

(2)

式中,X-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的總酚濃度(mg/mL)；V-待測(cè)樣品溶液定容總體積(mL)；N-稀釋倍數(shù)；V0-待測(cè)樣品溶液測(cè)定吸光度所用體積(mL)。

1.3.4 總抗氧化能力的測(cè)定

選用從南京建成生物工程研究所購(gòu)買的T-AOC試劑盒測(cè)定其總抗氧化能力，按試劑盒說(shuō)明書配置測(cè)定管和對(duì)照管。依據(jù)張馨妍等[22]和王苗苗等[23]的方法略作修改：精密量取0.1 mL待測(cè)樣品溶液與顯色劑充分混勻，并在37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，設(shè)置濃度為1 mg/mL Vc溶液為陽(yáng)性對(duì)照，配置后混勻、靜置10 min。以蒸餾水為空白對(duì)照，在520 nm下測(cè)定各管吸光度值。

總抗氧化能力/U·mL-1=[(ODU-ODC)·V·N]/(0.01×30×V0)

(3)

式中,ODU-測(cè)定管的吸光度值；ODC-對(duì)照管的吸光度值；V-測(cè)定時(shí)反應(yīng)液的總體積(mL)；N-樣品的稀釋倍數(shù)；V0-樣品取樣量(mL)。

1.3.5 DPPH·清除率的測(cè)定

精密稱取5 mg DPPH·并用無(wú)水乙醇溶解，定容在100 mL容量瓶中，用三蒸水將待測(cè)樣品溶液分別稀釋0、2、4、6、8倍。取2 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液，分別向其中加入2 mL DPPH·溶液與2 mL無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇、DPPH·溶液各2 mL為空白組，搖勻后在室溫下避光靜置30 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[24-25]。

DPPH·清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(4)

式中,Ai-待測(cè)樣品溶液+DPPH·溶液的吸光值；Aj-待測(cè)樣品溶液+無(wú)水乙醇的吸光值；A0-DPPH·溶液+無(wú)水乙醇的吸光值。

1.3.6 水楊酸體系中羥基自由基清除率的測(cè)定

分別取1.3.5中不同稀釋倍數(shù)的待測(cè)樣品溶液0.5 mL于試管中，按順序加入8 mmol/L的硫酸亞鐵溶液0.6 mL，20 mmol/L的雙氧水0.5 mL和3 mmol/L的水楊酸(無(wú)水乙醇溶解)2 mL，混勻后于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，流水冷卻。用無(wú)水乙醇作對(duì)照組，去離子水代替水楊酸作空白組，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，在510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[26-27]。

羥基自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(5)

式中,Ai-待測(cè)樣品溶液+水楊酸的吸光值；Aj-待測(cè)樣品溶液+無(wú)水乙醇的吸光值；A0-空白組的吸光值(去離子水代替水楊酸)。

1.3.7 超氧陰離子清除率的測(cè)定

按順序分別向試管中加入0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH值8.2)2.8 mL和3 mmol/L的鄰苯三酚0.1 mL，隨后再分別加入按1.3.5制備的不同稀釋倍數(shù)的待測(cè)樣品溶液0.5 mL、抗壞血酸溶液0.5 mL(對(duì)照組)、蒸餾水0.5 mL(空白組)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。反應(yīng)30 s后并每隔30 s在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其每次的吸光度值，反應(yīng)5 min[28]。

氧化速率=(最后一次記錄值-第1次記錄值)/5

(6)

清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(7)

式中,Ai-待測(cè)樣品溶液吸光值；Aj-對(duì)照組吸光值；A0-空白組吸光值。

1.3.8 還原力的測(cè)定

分別取1.3.5中不同稀釋倍數(shù)的待測(cè)樣品溶液1 mL于試管中，向其中加入pH值6.6的磷酸緩沖液和0.3%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻后于55 ℃水浴鍋中溫育20 min，取出后迅速冷卻，加入2.5 mL 10% 的三氯乙酸溶液，3 000 r/min下離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2 mL蒸餾水、0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液，充分混合，靜置10 min后在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)定吸光度值，吸光度值越大，代表還原力越強(qiáng)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)[29]。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。借助Excel、SPSS17.0相關(guān)軟件進(jìn)行圖表的繪制和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮、總酚含量

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液中總黃酮和總酚含量的影響如表1所示。結(jié)果顯示微生物發(fā)酵顯著提高了桔梗提取液中的總黃酮和總酚含量，且發(fā)酵組1中的含量最高，分別為3.927和5.871 mg/mL。

表1 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液中總黃酮和總酚含量的影響

2.2 總抗氧化能力

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液總抗氧化能力的影響如表2所示。結(jié)果顯示未發(fā)酵組與發(fā)酵組2之間沒有顯著性差異，且其總抗氧化能力與1 mg/mL的抗壞血酸相當(dāng)，而發(fā)酵組1的總抗氧化能力均顯著高于未發(fā)酵組、發(fā)酵組2與Vc對(duì)照組，可見，微生物發(fā)酵提高了桔梗提取液的總抗氧化能力。

表2 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液總抗氧化能力的影響

2.3 DPPH·的清除能力

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液DPPH·清除能力的影響如表3所示。

表3 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液DPPH·清除能力的影響

由表3可知，各組DPPH·清除能力均隨待測(cè)樣品溶液稀釋倍數(shù)的增加而降低，具有濃度依賴性。且稀釋倍數(shù)相同時(shí)，各組對(duì)DPPH·清除能力的強(qiáng)弱依次為發(fā)酵組1>發(fā)酵組2>未發(fā)酵組，組間差異顯著。

當(dāng)待測(cè)樣品溶液未被稀釋時(shí)，各組DPPH·清除能力均達(dá)到最大。其中，發(fā)酵組1的清除率最高，為90.73%；發(fā)酵組2為85.16%；未發(fā)酵組為80.23%?？梢?，微生物發(fā)酵顯著提高了桔梗提取液對(duì)DPPH·的清除能力。

2.4 水楊酸羥基清除能力

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液羥基清除能力的影響如表4所示。結(jié)果顯示，各組羥基清除能力均隨待測(cè)樣品溶液稀釋倍數(shù)的增加而降低。且發(fā)酵組1的羥基清除能力顯著高于發(fā)酵組2與未發(fā)酵組，但發(fā)酵組2與未發(fā)酵組間差異不顯著。

表4 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液羥基清除能力的影響

稀釋倍數(shù)相同時(shí)，綜合比較發(fā)現(xiàn)各組對(duì)羥基清除能力的強(qiáng)弱依次為發(fā)酵組1>發(fā)酵組2>未發(fā)酵組。當(dāng)待測(cè)樣品溶液未被稀釋時(shí)，各組羥基清除能力均達(dá)到最高。其中，發(fā)酵組1的清除率最大，為70.28%；發(fā)酵組2為61.54%；未發(fā)酵組為57.30%?？梢?，微生物發(fā)酵后顯著提高了桔梗提取液清除羥自由基的能力。

2.5 超氧負(fù)離子清除能力

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液超氧負(fù)離子清除能力的影響如表5所示。結(jié)果顯示，各組超氧負(fù)離子清除能力均隨待測(cè)樣品溶液稀釋倍數(shù)的增加而降低。稀釋倍數(shù)相同時(shí)，各組對(duì)超氧負(fù)離子的清除能力強(qiáng)弱依次為發(fā)酵組1>發(fā)酵組2>未發(fā)酵組，組間差異顯著。

表5 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液超氧負(fù)離子清除能力的影響

當(dāng)待測(cè)樣品溶液未被稀釋時(shí)，各組超氧負(fù)離子清除能力均達(dá)到最大。其中，發(fā)酵組1的清除率最大，為63.28%；發(fā)酵組2為54.68；未發(fā)酵組為47.74%?？梢?，微生物發(fā)酵后桔梗提取液的超氧負(fù)離子清除能力也會(huì)有顯著提高。

2.6 還原力

微生物發(fā)酵對(duì)桔梗提取液還原力的影響如表6所示。結(jié)果顯示，各組的還原力均隨待測(cè)樣品溶液稀釋倍數(shù)的增加而降低，且發(fā)酵組1與發(fā)酵組2均顯著高于未發(fā)酵組，但發(fā)酵組1與發(fā)酵組2間差異不顯著。

表6 發(fā)酵對(duì)桔梗提取液還原力的影響

稀釋倍數(shù)相同時(shí)，綜合比較發(fā)現(xiàn)各組還原力的強(qiáng)弱依次為發(fā)酵組1>發(fā)酵組2>未發(fā)酵組。當(dāng)待測(cè)樣品溶液未被稀釋時(shí)，各組還原力均達(dá)到最高。可見，微生物發(fā)酵顯著提高了桔梗提取液的還原力。

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌株發(fā)酵桔梗提取液后，總黃酮、總酚含量均顯著提高。王行等[30]通過(guò)測(cè)定藍(lán)莓酒發(fā)酵過(guò)程中酚類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)總酚、總黃酮含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，但仍顯著高于初始含量；陳彩云等[31]向槐米中接種納豆菌進(jìn)行發(fā)酵，提高了蘆丁和槲皮素含量。但該試驗(yàn)中不論是發(fā)酵或未發(fā)酵，各組液體中總黃酮、總酚含量均較低，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，購(gòu)買的桔梗片粉碎過(guò)篩成粉末，加入蒸餾水震蕩、提取、離心后制成的原始提取液中黃酮等含量會(huì)少于醇提、水提，黃酮更易溶于醇類試劑，故含量會(huì)較低[32]。錢驊等[33]也表明，抗氧化活性物質(zhì)如酚類、黃酮類等多存在于醇提物中。

在利用微生物發(fā)酵提高體外抗氧化能力方面，楊學(xué)娟[34]向豆粕中接種納豆芽孢桿菌進(jìn)行固體發(fā)酵，證明了豆粕提取物發(fā)酵后不僅在體外具有更高的清除DPPH自由基和超氧負(fù)離子的活性、還原力及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，而且在體內(nèi)也具有更高的抗氧化能力。因此，可以推斷發(fā)酵后的提取液，可能是因?yàn)樘岣呋蛏闪硕喾N具有抗氧化活性的物質(zhì)含量，從而使抗氧化能力得到顯著提高。因此，桔梗提取液經(jīng)微生物發(fā)酵后，研究其抗氧化能力顯著提高的機(jī)制也是很有必要的，以期為微生物發(fā)酵機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

桔梗提取液發(fā)酵組1、2中分別接種貝萊斯芽孢桿菌和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌株，并與未發(fā)酵的提取液做對(duì)比，研究桔梗提取液經(jīng)微生物發(fā)酵后抗氧化能力的變化，結(jié)果如下。

1)經(jīng)微生物發(fā)酵后，桔梗提取液中的總黃酮、總酚含量顯著提高，未發(fā)酵組與發(fā)酵組2之間沒有顯著性差異，且其總抗氧化能力與1 mg/mL的抗壞血酸相當(dāng)，而發(fā)酵組1的總抗氧化能力均顯著高于未發(fā)酵組、發(fā)酵組2與Vc對(duì)照組。

2)通過(guò)考察DPPH·、羥基自由基、超氧負(fù)離子的清除能力及還原力來(lái)研究其體外抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)各組清除自由基的能力和還原力均與樣品溶液濃度呈正相關(guān)，其中，發(fā)酵組的抗氧化能力顯著高于未發(fā)酵組，且發(fā)酵組1的體外抗氧化能力最強(qiáng)。因此，可以說(shuō)明微生物發(fā)酵能顯著提高桔梗提取液的體外抗氧化能力。