GPR110在IA期肺腺癌不同亞型中表達(dá)差異及意義

張 葉，余科科，邢 杰，丁聞潔，戎偉芳

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，在我國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率均位居各類腫瘤之首，其中肺腺癌是肺癌中最常見的組織學(xué)類型[1]。肺葉切除是臨床治療早期肺腺癌的傳統(tǒng)方式，IA期肺腺癌通常無需術(shù)后放化療[2-3]；但即使具有相同臨床指標(biāo)，患者預(yù)后也有顯著不同。課題組前期研究[4-5]顯示肺腺癌病理亞型是影響IA期肺腺癌患者的重要預(yù)后因素。

近期，GPR110多項(xiàng)研究被相繼報(bào)道。Lee et al[6]發(fā)現(xiàn)synaptamide是GPR110特異性配體，可觸發(fā)誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)元神經(jīng)、突觸發(fā)生。Ma et al[7]報(bào)道：GPR110在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)；敲除GPR110后削弱了肝細(xì)胞癌的發(fā)生。但GPR110在肺腺癌進(jìn)展中的作用及意義尚不明確。因此，該研究將分析GPR110在IA期肺腺癌不同病理組織亞型中表達(dá)差異與預(yù)后的相關(guān)性，探索一種新的肺腺癌特異性分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年1～12月肺腺癌石蠟標(biāo)本90例，其中附壁生長(zhǎng)型肺腺癌標(biāo)本(包括原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌和以附壁生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性腺癌)30例、以腺泡/乳頭樣為主的浸潤(rùn)性腺癌標(biāo)本30例、以微乳頭/實(shí)體為主的浸潤(rùn)性腺癌標(biāo)本30例，均取材于上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)前、術(shù)后診斷明確，所有標(biāo)本均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)生重新判讀、確認(rèn)其病理組織學(xué)亞型。所有標(biāo)本均為IA期肺腺癌，無遠(yuǎn)處器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床資料完整，術(shù)前均未接受放療、化療，且無其他基礎(chǔ)性疾病或急慢性病。同時(shí)選取炎癥石蠟標(biāo)本10例作為對(duì)照。其中男47例，女43例；年齡31～82(60.86±8.908)歲；腫塊大?。?1 cm 19例、1～2 cm 46例、>2 cm 25例，見表1。

表1 三種亞型臨床病理參數(shù)(n)

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑GPR110試劑：ADGRF1/GPR110 Antibody(N-Terminus) IHC-plusTM LS-A2021購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)操作具體步驟如下：① 切片:切3.5 m石蠟切片，70 ℃烤箱烤片1 h；② 脫蠟:石蠟切片使用EZ脫蠟液72 ℃脫蠟，沖洗液洗3次；③ 抗原修復(fù)：使用堿性細(xì)胞調(diào)節(jié)液CC1 95 ℃修復(fù)36 min，沖洗液沖洗3次；④ 一抗：36 ℃孵育32 min，沖洗液沖洗3次；⑤ 二抗：使用羅氏ultra viewDAB試劑盒，二抗36 ℃孵育8 min，DAB在36 ℃顯色8 min，沖洗液沖洗3次；⑥ 襯染:使用hematoxylin ii 36 ℃染色8 min，沖洗3次，返藍(lán)液Bluing reagent 36 ℃染色4 min，用沖洗液沖洗3次；⑦ 洗潔精水溶液浸泡免疫組化片3 min，水洗3次，表面無油漬即可；⑧ 脫水、透明，中性樹膠封片。

圖1 免疫組化法檢測(cè)GPR110在不同病理亞型肺腺癌中的表達(dá) ×200

1.3.2捷達(dá)形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(JEDA 801D)處理 GPR110染色定位在胞膜，陽(yáng)性信號(hào)的判定標(biāo)準(zhǔn)是胞膜棕黃色或黃色染色顯現(xiàn)。在附壁生長(zhǎng)組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實(shí)體組的肺腺癌標(biāo)本中，每組、每位患者的每張免疫組化切片，任取6個(gè)陽(yáng)性區(qū)域，測(cè)量切片的平均光密度值，統(tǒng)計(jì)分析每組GPR110表達(dá)水平的高低。

1.3.3隨訪 所有患者均隨訪5年，期間無1例失訪，隨訪率達(dá)100%。通過門診定期復(fù)查或電話聯(lián)系方式隨訪患者5年生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料采用單因素方差分析；兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線圖，并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)；所有檢驗(yàn)結(jié)果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌不同組織亞型中GPR110表達(dá)水平比較在附壁生長(zhǎng)組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實(shí)體組的肺腺癌組織標(biāo)本中GPR110的表達(dá)呈逐漸遞增趨勢(shì)，炎癥對(duì)照組未見陽(yáng)性表達(dá)，見圖1，平均光密度值分別為(0.484±0.073)、(0.500±0.058)、(0.542±0.073),3種亞型平均光密度經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，后經(jīng)兩兩比較可知，附壁生長(zhǎng)組與腺泡/乳頭組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；附壁生長(zhǎng)組與微乳頭/實(shí)體組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腺泡/乳頭組與微乳頭/實(shí)體組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 GPR110表達(dá)與臨床相關(guān)因素分析進(jìn)一步分析3種亞型中GPR110表達(dá)差異與臨床各因素的相關(guān)性。分別檢驗(yàn)3組中各因素平均光密度值可知：3種亞型肺腺癌患者性別、年齡、腫塊大小均與GPR110表達(dá)無相關(guān)性(P>0.5)(表2)。

2.3 不同組織亞型肺腺癌患者5年生存率與GPR110表達(dá)的相關(guān)性分析采用Kaplan-Meier繪制3種亞型累積生存曲線分析圖(圖2)，并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)，可知3種分型生存曲線比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析肺腺癌患者5年生存率的可能危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示：以微乳頭/實(shí)體型為參照組，附壁生長(zhǎng)型是微乳頭/實(shí)體型發(fā)生死亡的0.014倍；腺泡/乳頭型是微乳頭/實(shí)體型發(fā)生死亡的0.103倍?；颊?年生存率與性別、年齡、分化程度、腫塊大小無相關(guān)性(P>0.05)；與組織亞型密切相關(guān)，是肺腺癌患者5年生存的危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

圖2 3種亞型累積生存分析

表2 3種亞型GPR110表達(dá)與臨床相關(guān)因素分析

表3 90例肺腺癌患者5年生存危險(xiǎn)因素的COX回歸分析

3 討論

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是細(xì)胞膜上具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的受體蛋白，是人體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)家族。近40%的藥物是針對(duì)GPCR的，靶向這一完整的膜蛋白超家族成員的藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的核心。黏附G蛋白偶聯(lián)受體(adhesion G protein-coupled receptor, aGPCR)是數(shù)目第二多的GPCR家族，因胞外含有大量黏附蛋白中的結(jié)構(gòu)域而被廣泛認(rèn)為和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及識(shí)別等相關(guān)，是胞內(nèi)外信號(hào)連接的橋梁。GPR110是一種孤兒G蛋白偶聯(lián)受體，屬于aGPCR子家族。已有的研究表明多種黏附G蛋白偶聯(lián)受體蛋白在腫瘤中起著重要功能。如GPR116促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移；GPR126促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展[8-10]。Shi et al[11]研究發(fā)現(xiàn)GPR110在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于正常腦組織，高表達(dá)GPR110的膠質(zhì)瘤患者總體生存率較低，GPR110在不影響細(xì)胞增殖和遷移的前提下，增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲能力。

本研究檢測(cè)GPR110在IA期肺腺癌不同病理亞型，即附壁生長(zhǎng)組、腺泡/乳頭組、微乳頭/實(shí)體組中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示GPR110在3組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。炎癥對(duì)照組中未見陽(yáng)性表達(dá)。該結(jié)果與相關(guān)的研究[12-13]報(bào)道一致，提示GPR110可能是肺腺癌的潛在腫瘤標(biāo)志物，參與了肺腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡性進(jìn)展過程。同時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)，3種病理亞型中，性別、年齡、腫塊大小等因素中GPR110的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示GPR110的表達(dá)與性別、年齡、腫塊大小無相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)不同病理亞型肺腺癌患者5年生存率隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析發(fā)現(xiàn)：性別、年齡、分化程度、腫塊大小等因素對(duì)患者5年生存率無影響，而病理組織亞型是影響肺腺癌患者5年生存率的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；GPR110表達(dá)量較高的微乳頭/實(shí)體型患者與GPR110表達(dá)量較低的附壁生長(zhǎng)型患者相比，其累積生存時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，GPR110可能是潛在的早期肺腺癌患者術(shù)后預(yù)防性治療及危險(xiǎn)性預(yù)測(cè)的新的靶分子，通過檢測(cè)GPR110表達(dá)，可初步對(duì)早期肺腺癌患者進(jìn)行篩查并可對(duì)IA期不同組織亞型肺腺癌患者的5年生存率進(jìn)行預(yù)測(cè)、評(píng)估，對(duì)臨床診療具有輔助、指導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示GPR110在IA期不同病理亞型的肺腺癌中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差，提示GPR110可能參與了不同病理亞型肺腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并對(duì)預(yù)后產(chǎn)生影響。但由于研究樣本量較小，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以驗(yàn)證；同時(shí)，因無法定量分析，目前還不能成為提示早期肺腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。另?yè)?jù)報(bào)道[13]稱，GPR110分子結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生剪切，剪切產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)可以被檢測(cè)到，因此這也是未來的可能研究方向。綜上，根據(jù)本研究結(jié)果，GPR110可能參與肺腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但其參與的分子機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步的深入研究。