低分子肝素的工藝技術(shù)研究

魏海濤 方秋華 張炳順 劉初亮 劉鑠佳

摘 要 肝素被用于醫(yī)學(xué)上對靜脈血栓的治療，是常用的天然抗凝物質(zhì)，但其易產(chǎn)生出血等副作用。低分子肝素可以很好地彌補肝素的不可控性，但我國目前對低分子肝素的研究尚未成熟，因此本次研究主要對各種不同的制備工藝技術(shù)進(jìn)行歸納總結(jié)，并通過分子量檢測和抗凝血活性檢測作為判定依據(jù)，為低分子肝素的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 肝素;低分子量;工藝技術(shù)

肝素是一種天然糖胺聚糖類物質(zhì)，廣泛分布在哺乳動物臟器內(nèi)，常與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，在醫(yī)學(xué)上當(dāng)作抗凝藥物使用。但低分子肝素受降解工藝的影響，降解后的化學(xué)結(jié)構(gòu)也會不同，進(jìn)而影響其藥代動力學(xué)特征[1]。為了提供制備低分子肝素的理論依據(jù)，本次研究主要對所制備的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行簡述，以及其幾種制備工藝技術(shù)的總結(jié)歸納和對比，并選取最優(yōu)制備方法進(jìn)行結(jié)果檢測，現(xiàn)將試驗內(nèi)容總結(jié)如下。

1 肝素及低分子肝素的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 肝素的結(jié)構(gòu)與功能

肝素由兩種交替連接的糖醛酸和一種葡萄糖胺組成，這兩種糖醛酸以L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸的形式存在，另一種葡萄糖胺以α-D-葡萄糖胺的形式存在。在它們或其衍生物上可進(jìn)行硫酸化、乙?；鹊男揎棧垢嗡刈兊脧?fù)雜可變。天然存在的肝素總分子量多在4～30KDa之間，大部分集中于12～15KDa間[2] 。

人體的血液之所以能夠自由流動，依賴的是體內(nèi)的凝血與抗凝血系統(tǒng)。肝素可以加強或激活抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）的作用，從而延長凝血時間。這里主要闡述肝素的抗凝血反應(yīng)機制。

1.2 低分子肝素的結(jié)構(gòu)與功能

低分子肝素由肝素經(jīng)過物理、化學(xué)、生物酶等方法降解得到，因此其結(jié)構(gòu)序列與肝素相似，但分子量會變小，一般為3～8KDa。除了具有肝素的功能以外，低分子肝素也用于普通抗凝劑所不適用的治療中，如彌散性血管內(nèi)凝血以及改善中風(fēng)引起的血液高凝狀態(tài)等。

2 低分子肝素的制備

2.1 物理法制備低分子肝素

物理方法包括超濾法、凝膠過濾法、乙醇沉淀法、色譜法、超聲波等，操作簡單、高效可控，主要用于結(jié)構(gòu)的測定和生物活性的研究。物理法對低分子肝素結(jié)構(gòu)的破壞很少，但是普通肝素中含的低分子片段較少，取得率很低，所以物理法制備低分子肝素一般不用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 生物酶解法制備低分子肝素

生物酶解法使利用肝素酶的水解，將硫酸葡萄糖胺和硫酸艾杜糖醛酸之間的1，4-糖苷鍵斷裂形成末端殘基，該末端殘基在234nm處吸收值很高。目前為止生物酶解法的技術(shù)已相對成熟，反應(yīng)對環(huán)境無污染，但肝素酶的成本也比較高，一般不適宜應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 化學(xué)裂解法制備低分子肝素

化學(xué)裂解法所用的方法有多種，例如過氧化氫法、β-消除降解法和亞硝酸降解法等，它們的原理都是使肝素的糖苷鍵發(fā)生斷裂從而得到低分子肝素。其中亞硝酸法制備低分子肝素在工業(yè)化生產(chǎn)中更具優(yōu)勢，也是目前國際市場大多采取的方法。

（1）過氧化氫法

氧化物通過氧化作用使肝素中的糖苷鍵斷裂，制備出低分子肝素。同樣在一定溫度、酸堿度的條件下，可以制備出低分子肝素，但在生產(chǎn)過程中造成污染。

（2） β-消除降解法

β-消除降解法的優(yōu)點是通過控制其反應(yīng)條件，可以獲得較為均一的低分子肝素;參加反應(yīng)的試劑在最終產(chǎn)品中不存在。但缺點是工藝煩瑣，對技術(shù)要求高，成本高，穩(wěn)定性能也稍遜一籌。

（3） 亞硝酸降解法

亞硝酸降解法是將肝素在酸性條件下加入解聚劑，經(jīng)過一段反應(yīng)時間使糖苷鍵斷裂，再將pH值調(diào)至中性終止反應(yīng)。該法是目前制備低分子肝素使用的最廣泛的工藝技術(shù)，通過控制不同反應(yīng)條件，可有效降低肝素分子量。

3 低分子肝素的分析檢測

目前對低分子肝素的檢測手段有很多，主要使用高效液相色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核磁共振法、質(zhì)譜法等手段。本實驗應(yīng)用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，它采用使試樣中各組分發(fā)生電離的基本原理，最后通過荷質(zhì)比進(jìn)行計算獲得結(jié)果。因亞硝酸降解法在工業(yè)化生產(chǎn)上最為常見，此處以亞硝酸降解法為例。

4 低分子肝素生物活性的測定

低分子肝素的抗凝血因子FXa與抗凝血因子FⅡa的活性效價受其分子量的影響，除此之外組成低分子肝素的單糖排列方式以及取代基的不同均可導(dǎo)致不同的生物活性。對于低分子肝素生物活性的最終判定以效價為指標(biāo)。詳細(xì)可見表1。

通過上表1的數(shù)據(jù)可知，低分子肝素與肝素的抗FXa生物活性相比變化幅度很小，這說明經(jīng)亞硝酸降解法制備的低分子肝素能夠很好的保留其抗凝血活性;而低分子肝素的抗FⅡa的活性卻下降了許多，這說明低分子肝素的安全性較肝素高，副作用有所減小。可信限率FL%是精密度的標(biāo)志，與肝素相比低分子肝素的可信限率更低，及可信度更高。數(shù)據(jù)顯示該法基本達(dá)到了制備低分子肝素的目的。

5 結(jié)束語

通過對幾種不同低分子肝素工藝技術(shù)的歸納，得知采用亞硝酸降解法制備低分子肝素最具可行性，且通過檢測結(jié)果可知其制備的低分子肝素能夠很好地達(dá)到制備目標(biāo)。因此今后在研究低分子肝素來源上和更高效的制備低分子肝素的工藝上，仍有許多值得我們探討的地方。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉欣悅.質(zhì)譜聯(lián)用新技術(shù)在低分子肝素藥物質(zhì)量控制方面的應(yīng)用[D].濟南：山東大學(xué)，2018.

[2] 黃滿紅.肝素的提取精制和亞硝酸法制備低分子肝素的研究[D].西安：陜西科技大學(xué)，2016.