醬醪配制階段添加良性乳酸菌解決醬油二次沉淀的研究

滑歡歡 王聰 扈圓舒 符姜燕 李婕

摘 要：根據(jù)乳酸菌顯微鏡細(xì)胞形態(tài)、耐鹽性試驗(yàn)、產(chǎn)物中有害物質(zhì)含量（組胺和酪胺），從菌種庫3株乳酸菌中鑒定出R3為良性乳酸菌;通過擴(kuò)大培養(yǎng)工藝，使得R3乳酸菌培養(yǎng)液的細(xì)胞數(shù)達(dá)到109;將培養(yǎng)液在醬醪配制階段添加至醬醪中，發(fā)酵180d后，試驗(yàn)罐的天然油的二次沉淀是對照樣的10%。

關(guān)鍵詞：良性乳酸菌;細(xì)胞形態(tài);耐鹽性試驗(yàn);組胺和酪胺

中圖分類號(hào) TS264文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）09-0131-04

Study on a Long-term Preservation Method of Aspergillus

Hua Huanhuan et al.

（Guangdong Meiweixian Flavoring Foods Co.， Ltd.， Zhongshan 528400， China）

Abstract： Brown rice with water to cook for 15min， the boiled brown rice and bran are mixed with 5∶1 by weight，taking them into the flask. Each triangular flask has a thickness of 7-10cm medium，triangle bottle with tampons and kraft paper seal，sterilization at 121℃ 20min. Inoculated with Aspergillus oryzae in the Erlenmeyer flask， 35℃ culture 72h. The mature Aspergillus oryzae was vacuum dried to about 10% moisture， the dried bacteria were stored in a refrigerator at-20℃， save for up to 20 years.

Key words： Btown rice; Vacuum dry; Dry and frozen

1 引言

醬油是人們生活所必需的調(diào)味品之一，我國每年均會(huì)大量出口醬油。雖然我國出口的醬油都是選用上等原料生產(chǎn)的，產(chǎn)品出廠經(jīng)嚴(yán)格滅菌、過濾、檢測等工序，出口時(shí)無沉淀物，但經(jīng)一段時(shí)間庫存和銷售的醬油有二次沉淀析出，使醬油質(zhì)量下降，從而影響了醬油在國際市場的競爭力。醬油在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的各個(gè)階段都可能產(chǎn)生沉淀，從發(fā)酵罐中放出來的未經(jīng)滅菌的醬油稱為原油，這種原油產(chǎn)生的沉淀稱為原沉淀;原油加熱處理后，放置一段時(shí)間后生成的沉淀物稱為一次沉淀;成品醬油在儲(chǔ)存或貨架銷售過程中產(chǎn)生的沉淀為二次沉淀。二次沉淀的產(chǎn)生是當(dāng)今我國醬油行業(yè)普遍存在的尚未解決的一大難題。經(jīng)顯微鏡檢測及成分分析，二次沉淀主要是大量菌體聚集而成，其次是原料中未分解的蛋白質(zhì)組成。

本研究旨在提供一種醬醪中添加良性乳酸菌，以抑制惡性乳酸菌的增殖，從而減少醬油中的惡性乳酸菌菌體;惡性乳酸菌細(xì)胞單個(gè)、分散的存在于醬醪中，良性乳酸菌細(xì)胞幾個(gè)連接在一起，成團(tuán)存在于醬醪中。原油過濾時(shí)，可以將良性乳酸菌的菌體除去，進(jìn)而解決醬油二次沉淀的問題。

2 材料與方法

2.1 供試材料 釀造醬油生產(chǎn)原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購。乳酸菌：廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司菌種庫提供。酵母抽提物、牛肉膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀等試劑：由廣州化學(xué)試劑廠提供。

2.2 主要設(shè)備 顯微鏡、培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、NK式蒸煮鍋、發(fā)酵池、發(fā)酵罐。

2.3 培養(yǎng)基 配方1（MRS培養(yǎng)基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸二胺2g、吐溫801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g、瓊脂20g、氯化鈉58.5g、蒸餾水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀2g、吐溫801g、乙酸鈉5g、瓊脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄醬瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄醬100g、乳糖20g、氯化鈉5g、碳酸鈣10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4 試驗(yàn)方法

2.4.1 乳酸菌分離純化培養(yǎng)基配方的確定 配方1（MRS培養(yǎng)基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸二胺2g、吐溫801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g、瓊脂20g、氯化鈉58.5g、蒸餾水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁瓊脂培養(yǎng)基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀2g、吐溫801g、乙酸鈉5g、瓊脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄醬瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄醬100g、乳糖20g、氯化鈉5g、碳酸鈣10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4.2 乳酸菌分離純化方法的確定 方案1（稀釋涂布法，有氧培養(yǎng)）：（1）將分別盛有9mL生理鹽水的6支試管滅菌，并按順序進(jìn)行編號(hào);（2）用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入試管中，用手指輕壓移液管上的橡皮，吹吸3次，使菌液與水充分混勻;（3）從10-1倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入10-2倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的混勻操作，以此類推，直到完成最后1支試管的稀釋;（4）取少量菌液滴加在培養(yǎng)基表面，用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面方案2（二重皿扁平培養(yǎng)法，見圖1厭氧培養(yǎng)）：將干熱滅菌的培養(yǎng)皿的蓋皿，按常法進(jìn)行平板培養(yǎng)，流入培養(yǎng)基還沒有凝固前，將底皿的底面壓入蓋皿培養(yǎng)基內(nèi)，令其凝固，蓋皿和底皿之間的空隙則用熔化的石蠟加以密封，隔絕空氣，將其放在無菌大型培養(yǎng)皿內(nèi)。

2.4.3 通過乳酸菌顯微鏡細(xì)胞形態(tài)確定乳酸菌的優(yōu)劣 通過顯微鏡檢測乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)，幾個(gè)細(xì)胞粘連在一起的乳酸菌稱為良性乳酸菌。使用顯微鏡對經(jīng)相同條件下（相同培養(yǎng)基、相同培養(yǎng)溫度和無氧條件）擴(kuò)大培養(yǎng)的3株乳酸菌培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢，步驟如下：（1）配制1.5LMRS液體培養(yǎng)基，分裝于3個(gè)1L的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝500mL;（2）將分裝好的培養(yǎng)基于121℃、滅菌30min，冷卻，備用;（3）將3株乳酸菌分別接種于滅過菌的培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)5d;（4）將蓋玻片用酸洗液浸泡10s左右，用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，用擦鏡紙擦拭干凈。此步驟中不能用酒精點(diǎn)燃?xì)⒕駝t蓋玻片會(huì)斷裂;（5）用滴管滴半滴蒸餾水于載玻片上，使用滅過菌玻璃吸管吸取培養(yǎng)物，滴一滴培養(yǎng)物于載玻片上;（6）蓋上蓋玻片，確保無氣泡;（7）觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照。

2.4.4 通過耐鹽性試驗(yàn)確定3株乳酸菌的優(yōu)劣 （1）配制1.5L高鹽分的乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)基（頭油10%、葡萄糖5%、鹽分18%），分裝于3個(gè)1L的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝500mL;（2）將分裝好的培養(yǎng)基于121℃、滅菌30min，冷卻，備用;（3）將3株乳酸菌分別接種于滅過菌的培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)5d，每天檢測培養(yǎng)物的pH和細(xì)胞數(shù);（4）通過檢測培養(yǎng)物的pH和細(xì)胞數(shù)，確定這3株乳酸菌在高鹽培養(yǎng)基條件的生長情況;（5）選出耐鹽性強(qiáng)的乳酸菌，更適于醬油釀造。

2.4.5 通過檢測產(chǎn)物中有害物質(zhì)的含量（組胺和酪胺）判斷乳酸菌優(yōu)劣 （1）實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制作大曲：蒸熟的黃豆與面粉按照1∶0.4比例混合，接種米曲霉3.042，裝入鋁飯盒中于30℃恒溫培養(yǎng)44h，制得成熟的大曲;（2）實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制醪：取150g大曲與450g23波美的鹽水混合制成醬醪，裝于1個(gè)1L三角瓶種;（3）分別取實(shí)驗(yàn)例2中培養(yǎng)好的3種乳酸菌添加至3瓶醬醪中，使得每瓶醬醪中乳酸菌的細(xì)胞數(shù)達(dá)到106，以不添加乳酸菌的那瓶醬醪為對照樣;（4）將添加乳酸菌的醬醪放置在30℃培養(yǎng)箱，恒溫發(fā)酵30d，每10d檢測上清液的pH，發(fā)酵完成后，檢測上清液中組胺和酪胺的含量，進(jìn)而判斷這3株乳酸菌的優(yōu)劣。

2.4.6 篩選出的良性乳酸菌R3應(yīng)用于醬油釀造解決二次沉淀問題 （1）將乳酸菌R3按照以上擴(kuò)大培養(yǎng)的方法擴(kuò)大培養(yǎng)，使得細(xì)胞數(shù)達(dá)到109;（2）將培養(yǎng)好的乳酸菌R3添加至的面積為65m2的發(fā)酵罐的醬醪中，使得醬醪中的細(xì)胞數(shù)為106，添加時(shí)機(jī)為醬醪配制階段添加乳酸菌;（3）以同一天投料的，未添加乳酸菌的65m2發(fā)酵罐為對照罐;（4）發(fā)酵過程管理：發(fā)酵時(shí)間為3d、7d、15d、30d、45d、60d、90d復(fù)油攪拌醬醪，發(fā)酵180d放出頭油;（5）用0.1μm膜過濾法過濾天然油，過濾后的天然油經(jīng)煮制、調(diào)配、熱沉3d，取上清液，裝入玻璃瓶，封口，常溫放置60d，觀察醬油的二次沉淀。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌分離純化培養(yǎng)基的配方 由表1可知：用配方1分離純化得到的乳酸菌細(xì)胞數(shù)最多，說明培養(yǎng)基配方1最適用于乳酸菌的生長。

3.2 乳酸菌分離純化的方法 由圖2、圖3及表2可知：分離純化乳酸菌時(shí)，用二重皿扁平培養(yǎng)法得到的細(xì)胞數(shù)高于稀釋涂布法。說明乳酸菌在厭氧條件下生長的好，乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，需厭氧培養(yǎng)。

3.3 3株乳酸菌的細(xì)胞形態(tài) 圖4是在中國微生物網(wǎng)購買的嗜鹽片球菌，命名為R1，從細(xì)胞形態(tài)看，單個(gè)細(xì)胞排列、較分散;圖5是上海微生物釀造研究所購買的乳酸菌，命名為R2，從細(xì)胞形態(tài)看，是乳酸菌桿菌;圖6是我司醬醪中分離得到的乳酸菌，命名為R3，從細(xì)胞形態(tài)看，是幾個(gè)細(xì)胞連接在一起的片球菌。由此可見，醬醪中分離得到的乳酸菌為良性乳酸菌，更適于醬油釀造解決二次沉淀。

3.4 3株乳酸菌的耐鹽性 由表3可知，R1和R2這2株乳酸菌在高鹽條件下擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，pH值下降緩慢，說明其生長繁殖較慢，產(chǎn)乳酸的含量低，乳酸菌R3更適合生長于高鹽的培養(yǎng)基，pH下降快速，說明其繁殖能力強(qiáng)。由表4可知，R1和R2這2株乳酸菌在高鹽條件下擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖較慢，培養(yǎng)至5d時(shí)細(xì)胞數(shù)為107，乳酸菌R3培養(yǎng)至5d時(shí)細(xì)胞數(shù)為109，達(dá)到目標(biāo)值，說明醬醪分離得到的乳酸菌更適合生長于高鹽培養(yǎng)基。

由表5可知，添加乳酸菌R3發(fā)酵的水黃中組胺和酪胺含量最少，說明乳酸菌R3更適于醬油釀造。

3.5 乳酸菌R3解決醬油釀造解決二次沉淀的效果 由表6可知，添加乳酸菌R3發(fā)酵的醬油二次沉淀析出的時(shí)間比未添加乳酸菌的醬油晚，且放置60d時(shí)添加乳酸菌的醬油二次沉淀減少很多。試驗(yàn)證明，添加良性乳酸菌可以解決醬油中的二次沉淀問題，同時(shí)充分說明醬油中的二次沉淀主要是由惡性乳酸菌的菌體構(gòu)成的。

4 結(jié)論

以MRS培養(yǎng)基配方及二重皿扁平培養(yǎng)法分離得到的3株乳酸菌，根據(jù)乳酸菌的顯微鏡細(xì)胞形態(tài)、耐鹽性試驗(yàn)、產(chǎn)物中有害物質(zhì)含量（組胺和酪胺），鑒定出乳酸菌R3（公司醬醪中分離得到的乳酸菌）為良性乳酸菌;通過擴(kuò)大培養(yǎng)工藝，使得R3乳酸菌培養(yǎng)液的細(xì)胞數(shù)達(dá)到109;將培養(yǎng)液在醬醪配制階段添加至醬醪中，發(fā)酵180d后，試驗(yàn)罐的天然油的二次沉淀是對照樣的10%。

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（責(zé)編：張宏民）