改性纖維素納米微晶增強(qiáng)角蛋白載藥膜材料的制備及性能研究*

宋凱利，朱笑吉，朱衛(wèi)明

(1. 浙江理工大學(xué) 生態(tài)染整技術(shù)教育部工程研究中心，杭州 310018;2. 浙江省清潔染整技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 紹興 312000)

0 引 言

角蛋白優(yōu)異的生物學(xué)特性使得角蛋白膜作為藥物載體在傷口敷料、創(chuàng)口愈合材料等領(lǐng)域有突出的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[1-3]，作為藥物載體膜除了要求具有良好的藥物承載和釋放能力外，還需具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，避免使用時(shí)材料受到破壞而出現(xiàn)爆發(fā)性釋放，以期具有穩(wěn)定的使用性能和良好的藥物釋放能力[4-6]。角蛋白膜材料強(qiáng)度低，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)纖維素納米微晶可實(shí)現(xiàn)對(duì)角蛋白材料的力學(xué)增強(qiáng)，但會(huì)使膜的斷裂延伸性能有所下降，這就使得角蛋白膜材料的應(yīng)用受到限制。這和纖維素納米微晶與角蛋白基體之間界面結(jié)合較弱有關(guān)，納米填料與基體材料之間的界面層作為復(fù)合材料一個(gè)重要的微結(jié)構(gòu)[7-9]，不僅起著連接增強(qiáng)材料與基體的橋梁作用，也是外加負(fù)荷從基體向增強(qiáng)材料傳遞的紐帶，因此對(duì)復(fù)合材料的宏觀性能有重要的影響[10-13]。

有研究者為改善纖維素納米微晶與基體材料之間的界面結(jié)合，而對(duì)納米微晶進(jìn)行改性。如Kim等人采用表面活性劑改變纖維素納米微晶的極性，從而提高其與疏水基體材料的界面結(jié)合[14]。Yu等人采用化學(xué)接枝改性來(lái)提高纖維素納米微晶與基質(zhì)之間的結(jié)合力，從而提高復(fù)合材料的界面強(qiáng)度[15]。纖維素納米微晶表面的羥基具有一定的化學(xué)反應(yīng)活性，可通過(guò)氧化反應(yīng)將其氧化生成醛基，而醛基的引入則可賦予纖維素納米微晶一些特定的反應(yīng)功能性[16-18]。引入的醛基可與角蛋白分子中氨基發(fā)生反應(yīng)，生成化學(xué)交聯(lián)鍵，化學(xué)交聯(lián)鍵的建立有利于提高纖維素納米微晶與角蛋白基體相之間的界面結(jié)合，進(jìn)而較好地改善復(fù)合材料的性能[19-20]。

在研究中，我們采用高碘酸鈉氧化法在纖維素納米微晶表面引入反應(yīng)性官能團(tuán)-醛基，得到醛基化纖維素納米微晶 (DCNC)。系統(tǒng)研究了纖維素納米微晶的氧化改性，將醛基化纖維素納米微晶作為增強(qiáng)體制備了角蛋白復(fù)合膜，詳細(xì)研究了復(fù)合膜的各項(xiàng)性能，探討了改性纖維素納米微晶對(duì)復(fù)合膜的增強(qiáng)增韌機(jī)制。將得到的性能最好的角蛋白復(fù)合膜材料為藥物載體，研究了其對(duì)包覆藥物的釋放行為。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、藥品

纖維素粉：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；硫酸：分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司；冰醋酸：分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司；尿素：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；L-半胱氨酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 醛基化纖維素納米微晶的制備

硫酸水解法提取CNC：稱取1 g纖維素粉，緩慢加入50 mL 64%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硫酸溶液中，在溫度為45 ℃的水浴中水解55 min。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的混合液離心，收集離心所得固體產(chǎn)物，水洗4～5次。最后將CNC懸浮液裝入截留分子量為5000的透析袋中透析2天。采用高碘酸鈉作為氧化劑，在一定的物料比、溫度和時(shí)間下對(duì)纖維素納米微晶進(jìn)行氧化改性。之后透析除去未反應(yīng)的氧化劑。

1.3 角蛋白的制備

稱取10 g動(dòng)物羽毛，溶解在8 mol/L的尿素溶液中，再加入對(duì)羽毛質(zhì)量5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的L-半胱氨酸還原劑，浴比為1∶100，在85 ℃水浴中反應(yīng)7 h，得到角蛋白懸浮液。將該懸浮液離心，收集上清液，裝入透析袋中，用大量去離子水透析2天。用等電點(diǎn)沉降法使角蛋白沉淀，并離心收集固體，冷凍干燥，得到角蛋白固體粉末。

1.4 醛基化纖維納米微晶增強(qiáng)角蛋白載藥膜的制備

稱取6 g角蛋白，溶解在94 g體積比為4∶1的醋酸/水溶液，超聲脫泡。在角蛋白制膜液中加入角蛋白質(zhì)量5.0%的丙三醇增塑劑，采用溶液澆鑄法制備純角蛋白膜。改性纖維素納米微晶/角蛋白復(fù)合膜制備如下：將角蛋白溶液與改性纖維素納米微晶溶液按m(CNC)∶m(Keratin)為1%、2.5%、5%、10%的比例混合，攪拌均勻，倒入聚四氟乙烯制膜板上制膜。

慶大霉素是一種氨基糖苷類的廣譜抗生素，對(duì)多種陰性菌及陽(yáng)性菌都具有較強(qiáng)的抑制和殺菌作用，用于小面積傷口處理具有防止傷口感染的效果，本實(shí)驗(yàn)采用慶大霉素作為藥物模型測(cè)試角蛋白復(fù)合膜藥物緩釋性能。選用5.0%∶ DCNC/角蛋白復(fù)合膜為載藥膜基體材料，藥物包覆過(guò)程如下：在20 mL 5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) DCNC/角蛋白制膜液中加入60 mg慶大霉素固體，攪拌溶解后倒入制膜板內(nèi)待溶劑揮發(fā)得到包覆藥物的角蛋白復(fù)合膜。

1.5 醛基化纖維素納米微晶的表征

1.5.1 DCNC醛基含量的測(cè)定

醛基含量的測(cè)定原理為：采用鹽酸羥胺溶液與DCNC中醛基反應(yīng)生成肟，同時(shí)生成鹽酸產(chǎn)物，使用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定生成的鹽酸，再通過(guò)消耗的氫氧化鈉體積反推出纖維素納米微晶上醛基的含量[18]。反應(yīng)方程式如(1)所示:

(1)

在滴定之前先用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液 (0.1 mol/L) 將配置好濃度為0.05 mol/L的鹽酸羥胺溶液pH值調(diào)至5，以除去鹽酸羥胺溶液中游離的鹽酸。準(zhǔn)確稱取1 g凍干所得的醛基化纖維素納米微晶，置于100 mL燒杯中，加入50 mL去離子水，用氫氧化鈉溶液將上述懸浮液pH值調(diào)至5，之后加入精確體積的40 mL上述pH值為5的鹽酸羥胺溶液，在40 ℃下反應(yīng)4 h，然后用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定上述反應(yīng)液至pH值為5，平行做3次，記錄每次使用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉體積，同時(shí)平行做3組空白對(duì)照 (使用相同質(zhì)量的纖維素納米微晶作為空白組)。

1.5.2 DCNC形貌表征

采用SEM及TEM測(cè)試改性纖維素納米微晶的形貌。

1.6 醛基化纖維素納米微晶/角蛋白膜的測(cè)試與表征

1.6.1 DCNC/角蛋白納米復(fù)合膜的力學(xué)性能測(cè)試

將復(fù)合膜放在溫度為25 ℃，濕度為65%的環(huán)境下平衡24 h。然后用Instron3367萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試復(fù)合膜的拉伸性能，設(shè)定儀器參數(shù)為：夾距20 mm，拉伸速度20 mm/min。

1.6.2 DCNC/角蛋白納米復(fù)合膜耐水性能測(cè)試

將CNC/角蛋白復(fù)合膜放入烘箱干燥，稱重記為m1。在室溫下浸入超純水中3天，取出后烘箱烘干，稱量記為m2，按式(2)計(jì)算其質(zhì)量溶失率：

(2)

1.6.3 DCNC/角蛋白納米復(fù)合膜藥物釋放性能測(cè)試

將制備的角蛋白載藥膜材料置于含50 mL不同pH值緩沖液的錐形瓶中，放在37 ℃的恒溫振蕩箱中在30 r/min下振蕩，間隔一定時(shí)間用移液槍取出3 mL溶液，同時(shí)補(bǔ)加3 mL緩沖液 (采用pH值為3和5的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液以及pH值為7.4的0.1 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液)。采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定溶液中慶大霉素的含量，慶大霉素可與鄰苯二甲醛試劑發(fā)生衍生反應(yīng)，反應(yīng)物在332 nm處具有特性吸收，因此可通過(guò)紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)衍生物吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算慶大霉素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 DCNC的制備及表征

高碘酸鈉氧化纖維素是一種具有選擇性且副反應(yīng)較少的氧化反應(yīng)。纖維素分子中C6位羥基上的氫原子很容易與相鄰葡糖糖單元中氧原子形成氫鍵結(jié)合，而高碘酸鈉則主要進(jìn)攻葡萄糖單元上的C2-C3位仲羥基，將其氧化為醛基。反應(yīng)過(guò)程示意圖如圖1所示。

圖1 醛基化纖維素納米微晶制備過(guò)程圖Fig 1 Schematic illustrate the preparation of dialdehyde cellulose nanocrystal

氧化條件主要影響DCNC上醛基含量及其制備產(chǎn)率。圖2為不同反應(yīng)條件對(duì)醛基化纖維素納米微晶上醛基含量和產(chǎn)率的影響。圖2(a)為高碘酸鈉與纖維素納米微晶的質(zhì)量比對(duì)所得DCNC上醛基含量和產(chǎn)率的影響，隨著氧化劑用量的增加，所得醛基化纖維素納米微晶上醛基含量逐漸增加，直至氧化劑用量為微晶質(zhì)量的1.5 倍時(shí)微晶上醛基含量達(dá)到最大值。醛基化微晶的產(chǎn)率則隨著氧化劑用量的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，這是由于高碘酸鈉在氧化也會(huì)造成纖維素的氧化降解，造成醛基化纖維素納米微晶產(chǎn)率的下降。圖2(b)為反應(yīng)溫度對(duì)醛基含量和產(chǎn)率的影響，隨著反應(yīng)溫度由30 ℃升高至50 ℃時(shí)，醛基含量由1.6 mmol/g增加至2.7 mmol/g。從圖2(c)可知，氧化劑與微晶質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)溫度在40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h的條件下，所得產(chǎn)物醛基含量為2.1 mmol/g，產(chǎn)率為78%。

圖2 高碘酸鈉用量，反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)醛基化纖維素納米微晶上醛基含量及產(chǎn)率的影響Fig 2 Effect of NaIO4 dosage, temperature and reaction time on aldehyde content and yield of dialdehyde cellulose nanocrystal

采用FT-IR對(duì)醛基化纖維素納米微晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果如圖3所示。未改性的纖維素納米微晶呈現(xiàn)典型的纖維素紅外特征譜圖，對(duì)比醛基化纖維素納米微晶的紅外譜圖，其吸收峰的位置和強(qiáng)度基本上沒有發(fā)生變化，只是在1 732 cm-1處出現(xiàn)了新峰，該峰為醛基的特征吸收峰，說(shuō)明高碘酸鈉氧化后成功在纖維素納米微晶上引入了醛基。

圖3 醛基化纖維素納米微晶的紅外譜圖Fig 3 FT-IR spectra of dialdehyde cellulose nanocrystal

圖4為所得醛基化纖維素納米微晶的形貌及粒徑分布圖。從圖4(a)可知，DCNC形貌呈現(xiàn)典型的棒狀形態(tài)，由于凍干所得纖維團(tuán)聚現(xiàn)象較為嚴(yán)重，不能清晰觀察單根纖維的形貌，因此采用透射電子顯微鏡對(duì)醛基化纖維素納米微晶進(jìn)行形貌表征，如圖4(b)所示。醛基化纖維素納米微晶為棒狀或針狀形貌。如圖4(c)所示，所得醛基化纖維素納米微晶的平均粒徑在187 nm左右，其懸浮液如插圖所示呈現(xiàn)乳白色。

圖4 醛基化纖維素納米微晶的FE-SEM，TEM 圖以及粒徑大小分布圖 (插圖為醛基化纖維素納米微晶懸浮液照片)Fig 4 FE-SEM micrograph, TEM micrograph and particle size distribution of DCNC determined by dynamic light scattering (inset: digital graph of DCNCs suspension)

2.2 DCNC/角蛋白復(fù)合膜的制備及性能

醛基化纖維素納米微晶增強(qiáng)角蛋白基復(fù)合材料的制備如圖5所示。角蛋白制膜中加入相對(duì)于角蛋白質(zhì)量的1.0%，2.5%，5.0%以及10.0%的醛基化纖維素納米微晶，超聲分散均勻后在聚四氟乙烯基板上制膜，待溶劑揮發(fā)完全之后，在80 ℃的烘箱中加熱1.5 h以促進(jìn)醛基與角蛋白分子上氨基之間的反應(yīng)，在醛基化纖維素納米微晶與角蛋白之間建立化學(xué)鍵結(jié)合。

圖5 醛基化纖維素納米微晶增強(qiáng)角蛋白復(fù)合膜的制備流程圖Fig 5 Schematic plot of the preparation process of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

通過(guò)添加醛基化纖維素納米微晶來(lái)改善材料力學(xué)性能，因此測(cè)試了復(fù)合材料的斷裂強(qiáng)力及斷裂延伸性能，結(jié)果如圖6所示。從圖中可知未添加DCNC的純角蛋白膜的力學(xué)性能較差，斷裂強(qiáng)力和斷裂延伸均較低，其斷裂強(qiáng)力只有2.7 MPa，斷裂延伸為11.0%。與純角蛋白膜相比，添加DCNC之后復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力均有較大的增加，DCNC添加量為1.0%時(shí)復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力提高至8.5 MPa，且隨著DCNC添加量增加復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力大大增加，直到添加量為5.0%時(shí)，復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力達(dá)到最大值為23.5 MPa，再繼續(xù)增加DCNC的用量后復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力出現(xiàn)下降趨勢(shì)。DCNC的添加較好的改善了角蛋白復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力，與CNC相比，DCNC的添加對(duì)復(fù)合材料的力學(xué)性能改善效果較為理想。

圖6 醛基化纖維素納米微晶增強(qiáng)角蛋白復(fù)合膜的力學(xué)性能Fig 6 Mechanical properties of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

圖7為DCNC/角蛋白復(fù)合膜材料動(dòng)態(tài)力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果。圖7(a)為DCNC/角蛋白復(fù)合材料的貯能模量隨溫度的變化趨勢(shì)，隨著溫度的升高復(fù)合材料的貯能模量在100 ℃附近開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，此溫度范圍為材料的玻璃化區(qū)域，材料的貯能模量在此溫度范圍內(nèi)達(dá)到最大值，溫度低于材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度時(shí)材料處于橡膠態(tài)，材料的貯能模量較小。添加不同量的DCNC后復(fù)合材料的貯能模量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，這與上述復(fù)合材料斷裂強(qiáng)力變化趨勢(shì)類似。復(fù)合材料貯能模量的增加，可能是由以下原因?qū)е拢?1)纖維素納米微晶本身具有較高的模量，因此作為復(fù)合材料的增強(qiáng)相能夠大大改善材料的力學(xué)性能，使得角蛋白復(fù)合材料的貯能模量也大大提高；(2)醛基化改性的纖維素納米微晶與角蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，在纖維素納米微晶與角蛋白之間建立了化學(xué)鍵的結(jié)合，化學(xué)鍵的建立大大提高了增強(qiáng)相與基質(zhì)相之間的界面作用力，因此，使得兩相之間界面強(qiáng)度大大提高。在DCNC本身的增強(qiáng)效果與強(qiáng)界面作用力的共同作用下，復(fù)合材料的力學(xué)性能得到了較為理想的改善效果，因此使得復(fù)合材料的貯能模量增加。

圖7(b)為DCNC/角蛋白復(fù)合材料損耗因子隨溫度的變化趨勢(shì)。從圖中可以看出添加DCNC之后復(fù)合材料的tanδ波峰向高溫方向發(fā)生移動(dòng)。材料tanδ曲線的波峰表示材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg，添加DCNC之后一方面可與角蛋白分子鏈之間相互纏結(jié)，使得分子鏈的運(yùn)動(dòng)阻力增加，自由移動(dòng)變得困難；另一方面DCNC與角蛋白分子之間交聯(lián)鍵的建立，也使得角蛋白大分子鏈的自由移動(dòng)阻力增加，這兩方面的原因造成復(fù)合材料玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg的提高。

圖7 醛基化纖維素納米微晶增強(qiáng)角蛋白復(fù)合膜的動(dòng)態(tài)力學(xué)性能Fig 7 Dynamic mechanical thermal analysis of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

2.3 DCNC/角蛋白復(fù)合膜藥物緩釋性能研究

通過(guò)以上研究可知，采用DCNC增強(qiáng)可使得角蛋白膜材料的性能得到較好的改善，采用5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))DCNC增強(qiáng)的角蛋白復(fù)合膜為載藥材料，與純角蛋白膜材料進(jìn)行對(duì)比，以硫酸慶大霉素為藥物模型，研究了角蛋白基膜材料作為藥物緩釋載體的應(yīng)用性能，結(jié)果如圖8所示。圖8(a)～(c)分別為角蛋白基膜材料在pH值為3、5和7.4的緩沖液中隨時(shí)間變化的累積藥物釋放率。從3張圖中可知，純角蛋白膜對(duì)藥物均呈現(xiàn)爆發(fā)性釋放，說(shuō)明純角蛋白膜材料對(duì)包覆的藥物沒有持續(xù)緩釋的效果，這是因?yàn)榻堑鞍啄げ牧闲阅茌^差，在使用過(guò)程中容易發(fā)生破壞而使包覆的藥物突釋。這種藥物釋放規(guī)律的膜材料不能滿足作為傷口敷料材料對(duì)傷口持續(xù)給藥的要求。DCNC/角蛋白復(fù)合膜對(duì)包覆的藥物在60 h后仍有藥物釋放，說(shuō)明復(fù)合膜材料能使包覆的藥物緩釋，在傷口敷料材料等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖8 角蛋白膜材料在不同pH值條件下對(duì)包覆藥物的釋放性能Fig 8 Drug release profile of keratin films at different pH solution

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)在纖維素納米微晶上引入反應(yīng)性醛基官能團(tuán)，利用醛基與角蛋白氨基之間建立化學(xué)鍵結(jié)合，來(lái)改善纖維素納米微晶與角蛋白之間的界面作用力。制備了一種力學(xué)性能較好的角蛋白復(fù)合膜材料，并且研究了復(fù)合膜材料作為藥物載體的使用性能。研究表明，高碘酸鈉與微晶質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h條件下所得醛基化纖維素納米微晶的醛基含量為2.1 mmol/g，產(chǎn)率為78%。TEM證明改性纖維素納米微晶的形貌為針狀，F(xiàn)T-IR證明氧化改性沒有破壞纖維素微晶的化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)DCNC的添加量為5.0%時(shí)復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)力可由2.3 MPa提高到23.5 MPa，斷裂延伸由11.0%提高至30.0%。 且DCNC增強(qiáng)的角蛋白復(fù)合膜對(duì)藥物呈現(xiàn)緩慢釋放的規(guī)律，DCNC/角蛋白復(fù)合膜在50 h后仍有藥物釋放，說(shuō)明該復(fù)合膜材料具有較好的緩釋性。這種藥物釋放規(guī)律的載藥材料較適合作為傷口敷料材料應(yīng)用。