基于FRET效應(yīng)的碳量子點(diǎn)/銀納米粒子熒光探針測(cè)定西咪替丁的研究

張 潔，張?jiān)秸\(chéng)，李承佳，馬紅燕，李 恒，辛程宏，李昊陽(yáng)

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，延安市分析技術(shù)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

西咪替丁(Cimetidine，CMT)是一種抑制胃酸和胃蛋白酶分泌的常用藥物[1]，但長(zhǎng)期服用或劑量增大時(shí)會(huì)出現(xiàn)腹瀉、咽喉腫痛等不良現(xiàn)象，有關(guān)CMT含量的精準(zhǔn)、高效測(cè)定一直是研究熱點(diǎn)。目前，已報(bào)道的測(cè)定CMT的方法主要有高效液相色譜法[2]、化學(xué)發(fā)光法[3]、分光光度法[4-5]、質(zhì)譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]和熒光法[8]等。熒光法憑借樣品用量少、靈敏度高、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而受到青睞。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[9]是指當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)(分別為能量供體和能量受體)距離很近(<10 nm)且能量給體的熒光光譜與能量受體的激發(fā)光譜存在大部分交叉時(shí)，供體的能量轉(zhuǎn)移至受體而產(chǎn)生熒光信號(hào)變化的現(xiàn)象。FRET技術(shù)具有高靈敏、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于生化樣品[10]、食品[11]和金屬離子[12]的分析檢測(cè)。

碳量子點(diǎn)(CQDs)是一種激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)連續(xù)可調(diào)、光學(xué)穩(wěn)定性好、毒性低、水溶性好的新型碳納米材料，被廣泛用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)成像和生化分析等領(lǐng)域。目前CQDs的合成大多以富碳物質(zhì)為碳源，其制備過(guò)程復(fù)雜且對(duì)反應(yīng)儀器要求較高。近年來(lái)，一些利用天然生物質(zhì)，如蘑菇[13]、紅棗[14]、青柿子[15]制備CQDs的方法相繼出現(xiàn)，這些方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低且原料綠色環(huán)保無(wú)毒性。目前基于CQDs的FRET研究已有相關(guān)報(bào)道[16-18]，其以CQDs作為FRET體系的能量供體，另一物質(zhì)作為能量受體，如MnO2[16]、溴化乙錠(EtBr)[17]、玫棕酸鈉(Sodium rhodizonate)[18]等。而以CQDs為熒光供體，AgNPs為熒光受體，采用FRET技術(shù)測(cè)定CMT的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以楊桃(Carambola，CB)為碳源，通過(guò)一步水熱法合成了強(qiáng)熒光的CB-CQDs。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CB-CQDs的熒光發(fā)射峰位置λem為397 nm，與AgNPs在399 nm處的共振吸收峰之間存在較大程度的重疊，CB-CQDs與AgNPs之間可以發(fā)生FRET使CB-CQDs熒光猝滅，熒光信號(hào)“關(guān)閉”，而向CB-CQDs/AgNPs體系中加入CMT后，CB-CQDs的熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)，熒光信號(hào)重新“打開(kāi)”。因此基于CB-CQDs /AgNPs之間的FRET效應(yīng)及熒光信號(hào)的“關(guān)-開(kāi)”，提出了以CB-CQDs /AgNPs為探針熒光分析測(cè)定CMT的新方法，并對(duì)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了初步探究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2700型熒光分光光度計(jì)、HT7700型透射電鏡(日本日立)；IR Prestige-21型傅立葉變換紅外光譜儀、XRD-7000型X-射線粉末衍射儀(日本島津)；FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國(guó)愛(ài)丁堡)；8453型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫)。

準(zhǔn)確稱取CMT標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)0.025 3 g，加入到20 mL乙醇中攪拌溶解，并超聲5 min，待充分溶解后將溶液定容至100 mL容量瓶中，配制成濃度為1.0×10-3mol/L的 CMT標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩２鹛?羅賓森(BR)緩沖溶液( pH 6.0)。

AgNPs按照參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行制備：分別量取250 μL 0.1 mol/L AgNO3溶液、0.1 mol/L Na3C6H5O7·2H2O溶液及6 mL 5 mmol/L NaBH4溶液，依次滴入90 mL水中并磁力攪拌，滴加完成后再攪拌30 min。將所得產(chǎn)物避光靜置8 h后定容至100 mL棕色容量瓶中，置于4 ℃暗室，待用。根據(jù)紫外-可見(jiàn)吸收峰強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)粒徑的摩爾吸光系數(shù)[20]計(jì)算得到AgNPs濃度為2.5×10-10mol/L。

實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，水為超純水。楊桃購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CB-CQDs的制備稱取33.0 g去皮楊桃，用玻璃棒充分搗碎，置于50 mL 聚四氟乙烯(PTFE)水熱反應(yīng)釜中，加入1.50 mL水，攪拌均勻后置于180 ℃真空干燥箱內(nèi)反應(yīng)18 h，待溫度降至常溫后，依次用濾紙、微濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，將濾液定容至100 mL容量瓶中，即得到棕黃色CB-CQDs溶液。稀釋100倍得到工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CMT的測(cè)定在10 mL比色管中逐一加入上述CB-CQDs工作液2.00 mL、pH 6.0的BR緩沖液2.50 mL、AgNPs溶液2.00 mL以及不同濃度的CMT溶液，以水定容。于室溫下反應(yīng)20 min后，測(cè)定λex/λem=319 nm/397 nm下體系的熒光強(qiáng)度IF和未添加CMT溶液的CB-CQDs/AgNPs體系的熒光強(qiáng)度IF0，計(jì)算體系熒光恢復(fù)值ΔIF(ΔIF=IF-IF0)與CMT濃度之間的關(guān)系，λex和λem狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CB-CQDs的表征

2.1.1 CB-CQDs的形貌表征采用透射電鏡(TEM)對(duì)CB-CQDs進(jìn)行表征，如圖1所示，CB-CQDs分散度較好，分布較為均勻，平均粒徑為5.8 nm左右。

圖1 CB-CQDs的TEM圖(A)和粒徑分布圖(B)Fig.1 TEM image(A) and size distribution(B) of CB-CQDs

2.1.2 CB-CQDs的光譜特性圖2A為CB-CQDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)λex下的熒光光譜，由圖可知CB-CQDs發(fā)射峰的位置λem和強(qiáng)度受激發(fā)波長(zhǎng)λex的影響，當(dāng)λex由289 nm遞增到349 nm時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)λem由388 nm向長(zhǎng)波方向移動(dòng)至426 nm，熒光強(qiáng)度先增大后減小。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)λex為319 nm時(shí)，λem為397 nm，此時(shí)CB-CQDs的熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值。

使用XRD對(duì)CB-CQDs進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)表征，如圖2B所示。2θ=28.64°處為無(wú)定形碳的衍射峰，由此判定CB-CQDs的晶型為無(wú)定型碳。

圖2 CB-CQDs于不同λex下的熒光光譜(A)、XRD圖(B)、FTIR圖(C)和UV-Vis圖(D)Fig.2 Fluorescence spectra of CB-CQDs with different excitation wavelengths(A),XRD spectrum(B),FTIR(C) and UV-Vis absorption spectrum(D) of CB-CQDs

2.2 CB-CQDs/AgNPs體系對(duì)CMT的測(cè)定

圖3A為激發(fā)波長(zhǎng)λex=319 nm下不同體系的熒光光譜圖。由圖可知，在該激發(fā)波長(zhǎng)下，AgNPs、CMT以及二者反應(yīng)產(chǎn)物均無(wú)明顯熒光，故實(shí)驗(yàn)沒(méi)有背景影響。向CB-CQDs中加入AgNPs后，前者在λex=319 nm處的熒光強(qiáng)度明顯降低，熒光信號(hào)“關(guān)閉”；向該體系中繼續(xù)加入CMT，可使猝滅后的CB-CQDs熒光部分恢復(fù)，熒光信號(hào)重新“打開(kāi)”。由圖3B分析可得，CB-CQDs的熒光恢復(fù)值隨著CMT濃度的增加而增大，據(jù)此可基于該CB-CQDs /AgNPs熒光探針的“關(guān)-開(kāi)”實(shí)現(xiàn)對(duì)CMT的測(cè)定。

圖3 不同體系的熒光光譜(A)及隨CMT濃度增加CB-CQDs/AgNPs的熒光信號(hào)恢復(fù)圖(B)Fig.3 Fluorescence spectra of different systems(A) and fluorescence signal recovery of CB-CQDs/AgNPs with increasing cimetidine concentrations(B)

2.3 CMT測(cè)定條件優(yōu)化

2.3.1 pH值及緩沖溶液的優(yōu)化不同pH值的緩沖溶液對(duì)CB-CQDs/AgNPs的熒光強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響?？疾炝藀H值(2.0～8.0)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)表明，隨著pH值的增加，體系ΔIF逐漸增大，pH 6.0時(shí)，體系ΔIF最大，此后隨著pH值的增加ΔIF減小，因此實(shí)驗(yàn)選擇pH 6.0的緩沖溶液?？疾炝薆R、Na2HPO4-NaH2PO4、Na2HPO4-Na3C6H5O7·2H2O、C6H8O7-Na3C6H5O7·2H2O等不同種類的緩沖溶液(pH 6.0)及其用量(0.5～3.0 mL)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，使用2.50 mL的BR緩沖溶液時(shí)，體系的ΔIF最大。

2.3.2 CB-CQDs的用量對(duì)CB-CQDs的用量(0.5～2.5 mL)進(jìn)行了優(yōu)化。在0.5～2.0 mL范圍內(nèi)，隨著CB-CQDs用量的增加體系ΔIF增大，當(dāng)用量為2.0 mL時(shí)，體系的ΔIF達(dá)到最大值，但用量大于2.0 mL時(shí)，體系的ΔIF隨著CB-CQDs用量的增加而減小，故實(shí)驗(yàn)選擇2.0 mL作為CB-CQDs的最佳用量。

2.3.3 AgNPs的用量實(shí)驗(yàn)考察了AgNPs溶液用量(0.5～3.0 mL)對(duì)體系熒光恢復(fù)值ΔIF的影響。隨著AgNPs用量的增加，ΔIF增大。加入量為2.0 mL時(shí)，體系ΔIF達(dá)最大，繼續(xù)增加AgNPs用量時(shí)，體系的ΔIF反而降低。其原因是AgNPs溶液用量過(guò)大時(shí)，CMT的含量相對(duì)降低，從而無(wú)法有效抑制FRET效應(yīng)，故實(shí)驗(yàn)選擇2.0 mL作為AgNPs溶液的最佳用量。

2.3.4 體系的穩(wěn)定性向CB-CQDs/AgNPs體系中加入CMT溶液后，測(cè)定放置不同時(shí)間后體系的熒光恢復(fù)值ΔIF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著放置時(shí)間增加ΔIF增加，并在20 min時(shí)達(dá)最大，且在8 h內(nèi)基本保持不變。

2.3.6 檢出限及線性范圍在選定的反應(yīng)條件下，體系的ΔIF與CMT濃度在9.0×10-8～1.0×10-6mol/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，其線性方程為ΔIF=9.0×108c(mol/L)+32.713，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 6，檢出限(3σ/k)為1.9×10-8mol/L。

2.4 樣品測(cè)定

任意選取5片同批號(hào)的CMT片，研磨成粉，稱取適量(相當(dāng)于0.025 3 g CMT)藥品粉末，超聲使其于20 mL無(wú)水乙醇中充分溶解后定容至100 mL容量瓶，過(guò)濾，取適量濾液按照“1.2.2”方法測(cè)定，計(jì)算CMT片劑含量。

另于樣品溶液中分別加入3個(gè)濃度(0.2、0.5、0.8 μmol/L)水平的標(biāo)準(zhǔn)樣品，反應(yīng)20 min后，依次對(duì)各個(gè)樣品的3組混合液進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，每組測(cè)定5次，計(jì)算ΔIF。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線代入線性方程計(jì)算，回收率結(jié)果見(jiàn)表1。其加標(biāo)回收率為97.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.0%，表明CB-CQDs/AgNPs熒光探針可用于實(shí)際CMT樣品的檢測(cè)。

表1 CMT樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 1 Determination results of cimetidine in sample and recovery of the method(n=5)

2.5 反應(yīng)機(jī)理初探

為探討AgNPs對(duì)CB-CQDs的熒光猝滅機(jī)理，首先對(duì)CB-CQDs和CB-CQDs/AgNPs體系的熒光壽命進(jìn)行了測(cè)定，前者的加權(quán)平均熒光壽命[22]為3.32 ns，后者為1.58 ns，加入AgNPs后熒光壽命減小，表明AgNPs對(duì)CB-CQDs的猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅。

其次，掃描了CB-CQDs的熒光光譜和AgNPs的UV-Vis光譜，如圖4A所示。CB-CQDs熒光發(fā)射峰λem位置為397 nm(圖4A左側(cè)縱坐標(biāo))；AgNPs 在399 nm處有一共振吸收峰(圖4A右側(cè)縱坐標(biāo))，將CB-CQDs和AgNPs分別作為體系的能量供體與受體，二者峰之間存在較大程度的重疊，且該體系的分子間距小于10 nm，符合發(fā)生FRET的要求。據(jù)此可以推斷，AgNPs對(duì)CB-CQDs的熒光猝滅作用是FRET效應(yīng)。

圖4 CB-CQDs的熒光光譜和AgNPs的UV-Vis圖(A)以及不同濃度CMT加入AgNPs中的UV-Vis圖(B)Fig.4 Fluorescence spectrum of CB-CQDs and UV-Vis absorption spectrum of AgNPs(A),and UV-Vis absorption spectra of different concentrations of cimetidine added to AgNPs(B)

圖4B為AgNPs溶液中加入不同濃度CMT溶液時(shí)的吸收光譜。由圖可知，在波長(zhǎng)為399 nm處，CMT溶液的濃度越大，AgNPs的吸收峰越低。原因可能是AgNPs溶液中含有的檸檬酸鹽使得AgNPs較為分散，此時(shí)AgNPs吸收峰較高；而CMT的加入使AgNPs產(chǎn)生團(tuán)聚[23]，從而導(dǎo)致AgNPs吸收峰強(qiáng)度下降，并使得AgNPs與CB-CQDs間的FRET效應(yīng)被阻隔，導(dǎo)致CB-CQDs熒光恢復(fù)。反應(yīng)的可能機(jī)理見(jiàn)圖5。

圖5 CMT檢測(cè)機(jī)理圖Fig.5 Principle diagram for detection of cimetidine by the established system

3 結(jié) 論

通過(guò)一步水熱法制備了熒光性能好、水溶性好的綠色CB-CQDs。基于AgNPs與CB-CQDs間的FRET作用使CB-CQDs熒光猝滅及CMT與AgNPs間的團(tuán)聚作用使熒光重新恢復(fù)的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了熒光的“關(guān)-開(kāi)”響應(yīng)，并建立了以CB-CQDs /AgNPs為熒光探針的CMT檢測(cè)新方法。該研究拓寬了CQDs在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。