貯藏和解凍方式對(duì)大菱鲆嘌呤含量的影響

宋敏杰 李婷婷 任麗琨 謝 晶 勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連116600 3 上海海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 上海201306）

人體嘌呤代謝紊亂或攝入量過多會(huì)使體內(nèi)尿酸含量升高，從而引發(fā)高尿酸癥，繼而誘發(fā)痛風(fēng)。近年來，由于生活水平的提高以及膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率逐年遞增并向低年齡段發(fā)展[1-3]。研究表明，高尿酸癥與高血壓、高血脂等多種代謝紊亂綜合癥有密切聯(lián)系[4]。痛風(fēng)的治療和預(yù)防，除服用藥物外，最好的方法是通過控制飲食攝入來降低人體內(nèi)的嘌呤含量，合理的飲食和健康的生活方式能夠幫助縮短療程[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)嘌呤每日攝入量＜200 mg 的痛風(fēng)治愈患者與每日攝入量＞500 mg 的痛風(fēng)治愈患者相比，前者2年內(nèi)復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)低于后者，表明痛風(fēng)患者治愈后，長(zhǎng)期低嘌呤飲食有助于預(yù)防痛風(fēng)復(fù)發(fā)[6]。

大菱鲆是我國(guó)海水魚類養(yǎng)殖的重要品種，養(yǎng)殖量已居世界第一[7]。研究表明，大菱鲆魚體蛋白質(zhì)中含8 種人體必需氨基酸，并且魚皮中富含膠原蛋白，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品[8-9]。李婷婷等[10-11]研究了-2 ℃微凍貯藏過程中大菱鲆品質(zhì)的變化。結(jié)果顯示，大菱鲆在微凍條件下貨架期可達(dá)20 d；而在4 ℃冷藏過程中，貨架期為12 d。井月欣等[12]探究冷凍解凍循環(huán)對(duì)大菱鲆品質(zhì)的影響。王彩理等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)混鹽冰貯藏有良好的保鮮效果，在模擬冷鏈物流環(huán)節(jié)的動(dòng)態(tài)條件下能夠保持大菱鲆14～15 d 的貨架期。不同的解凍方式對(duì)魚肉有不同的影響[14-16]。目前針對(duì)不同貯藏和解凍方式對(duì)嘌呤含量的影響還沒有深入的研究。本文研究貯藏和解凍方式對(duì)大菱鲆不同部位嘌呤含量的影響，旨在為痛風(fēng)患者飲食提供參考，并為今后貯藏過程中嘌呤含量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大菱鲆，重（600±50）g，錦州林西水產(chǎn)市場(chǎng)。

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99.0%）、冰乙酸、三氟乙酸、甲酸、10%四丁基氫氧化銨均為色譜級(jí)，上海阿拉丁試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)），北京DIKMA 科技有限公司。

Agilent 1160 高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；DK-8D 型恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；分析天平，MET-TLER TOLEDO 公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜分析條件的選擇 參考崔素萍等[17]的方法稍作調(diào)整，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse C18Plus（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速：0.6 mL/min；柱溫：24 ℃；進(jìn)樣量：6.0 μL；DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。以四丁基氫氧化銨、冰醋酸、水以及甲醇的混合溶液作為流動(dòng)相，將四丁基氫氧化銨、冰醋酸和超純水按體積比1.5∶1.5∶997 混合，再將無水甲醇分別按體積分?jǐn)?shù)0%，2.0%，3.0%，5.0%，7.5%，10.0%與其混合，研究不同甲醇比例對(duì)4 種嘌呤分離程度的影響，選擇分離效果最優(yōu)的比例，作為最終流動(dòng)相。

1.2.2 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 用超純水將4 種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的單一儲(chǔ)備液（1 mol/L 的NaOH 助溶），等體積混合后稀釋配制成250，125，50，25，5，0.5 mg/L 的6 個(gè)質(zhì)量濃度，分別過0.22 μm 濾膜，在選定的色譜條件下測(cè)定嘌呤含量，得到峰面積。并以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品處理方法 參考凌云等[18]的嘌呤提取方法并稍作修改，具體操作如下：取0.2000 g 待測(cè)樣品于試管中，按體積比加入三氟乙酸∶甲酸∶水=5∶5∶1，90 ℃水浴12 min，于80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘余物用10 mL 流動(dòng)相復(fù)溶。

1.2.4 精密度 對(duì)同一混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算RSD，確定精密度。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 將魚肉絞碎，稱取6 份，每份0.2000 g，按照1.2.3 節(jié)的方法處理，并采用1.2.1節(jié)的色譜條件上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算RSD。

1.2.6 方法回收率 采用已知濃度的樣品，分別加入原濃度低倍、中倍和高倍3 個(gè)不同濃度的等體積嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其添加回收率。

1.2.7 樣品貯藏和解凍方法 將鮮活大菱鲆宰殺，取背部魚肉、內(nèi)臟、背部（深色一側(cè)）及腹部（白色一側(cè)）魚皮4 種樣品放入密封袋中。將這些樣品分成3 組，每組包含背部魚皮、腹部魚皮、魚肉和內(nèi)臟。第1 組于4 ℃冷藏，第2、3 組于-18 ℃（模擬家用冰箱的貯藏溫度）冰箱冷凍，并分別在第7 天和第14 天時(shí)將樣品放在40 ℃水浴鍋或15 ℃低速流水中解凍。測(cè)定第0 天、第7 天和第14 天3組樣品中的嘌呤含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

通過探究不同甲醇含量對(duì)4 種嘌呤分離度的影響，確定當(dāng)流動(dòng)相為混合液（四丁基氫氧化銨∶冰醋酸∶超純水=1.5∶1.5∶997，體積比）∶無水甲醇=95∶5 時(shí)，4 種嘌呤物質(zhì)顯著分離。

從圖1a、b、c 中可看出腺嘌呤和鳥嘌呤峰面未完全分離，并且次黃嘌呤和黃嘌呤存在拖尾現(xiàn)象。當(dāng)混合液與甲醇的體積比為95∶5 時(shí)，12 min內(nèi)4 種嘌呤完全分離。隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)提高，4種嘌呤峰保留時(shí)間縮短，峰高增加，分離度下降，出現(xiàn)雜峰。不同嘌呤的峰型差異明顯，因此選擇混合液與甲醇體積比95∶5 作為后續(xù)試驗(yàn)所用流動(dòng)相的配比。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2～5 可知，該方法在0.5～250 mg/L 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇對(duì)分離效果的影響Fig.1 Effects of different volume fraction of methanol on separation efficiency

圖2 腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Linear relationship of adenine

圖3 鳥嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Linear relationship curve of guanine

圖4 次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Linear relationship of hypoxanthine

圖5 黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Linear relationship of xanthine

2.3 方法精密度

對(duì)同一混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，結(jié)果如表1所示，4 種嘌呤物質(zhì)測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.25%～0.43%，表明儀器精密度良好。

2.4 方法重復(fù)性

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表2顯示，3 種嘌呤峰面積的RSD 分別為2.38%，4.81%，4.70%，0.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 方法回收率

由表3可知，腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的平均加標(biāo)回收率依次為107.35%，97.71%，103.10%和98.31%，表明本試驗(yàn)所用的嘌呤提取方法樣品損失少，準(zhǔn)確度高。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The precision results

表2 重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repeatability for four kind of purine

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 Recovery rates of samples with added specimen

2.6 新鮮大菱鲆中各部位嘌呤含量

現(xiàn)有研究表明，腺嘌呤和次黃嘌呤是誘導(dǎo)痛風(fēng)的主要嘌呤堿基[19]。由表4可知新鮮大菱鲆的魚肉、魚皮及內(nèi)臟均未檢測(cè)出黃嘌呤。此外，內(nèi)臟和腹部魚皮中未檢測(cè)出次黃嘌呤。內(nèi)臟中腺嘌呤含量高于其它部位，因此在食用時(shí)要徹底清除內(nèi)臟。大菱鲆魚皮含有豐富的膠原蛋白，有一定的抗疲勞作用[20]，而其嘌呤含量較高，其中背部魚皮嘌呤總含量高于腹部魚皮。對(duì)于高尿酸血癥及痛風(fēng)患者而言，吃魚的時(shí)候要避免食用魚皮。新鮮魚肉中的嘌呤總含量相對(duì)較低，為44.3853 mg/100 g。

表4 新鮮大菱鲆中不同部位嘌呤含量Table 4 Purine content in different parts of fresh turbot

2.7 大菱鲆不同貯藏及解凍方式總嘌呤變化

如圖6所示，不同貯藏溫度及解凍方式下總嘌呤含量變化均呈先升后降的趨勢(shì)，且經(jīng)貯藏的魚肉嘌呤總量比新鮮魚肉高，其中流水解凍的魚肉總嘌呤含量少于溫水解凍。推測(cè)可能是由于流動(dòng)水的滲入對(duì)魚肉組織內(nèi)部的嘌呤進(jìn)行了稀釋。此外，流動(dòng)水的沖刷作用使魚肉中的嘌呤不斷向解凍環(huán)境中轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致樣品中嘌呤含量減少。有研究表明，隨著解凍溫度的升高，魚肉中肌纖維收縮，肌束空隙擴(kuò)大，不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)變，使肌肉組織中的自由水含量增大[21]，從而轉(zhuǎn)移了嘌呤，這也是40 ℃溫水解凍魚肉嘌呤含量減少的原因之一。

由圖7～8 可知，魚皮中的嘌呤含量始終呈下降趨勢(shì)。如圖8所示，4 ℃貯藏的大菱鲆腹部魚皮中嘌呤總含量在第7 天的測(cè)試結(jié)果相比其它兩組偏高。且由表4可知，魚皮中嘌呤以鳥嘌呤為主，含有少量腺嘌呤。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，腹部魚皮中出現(xiàn)次黃嘌呤和黃嘌呤，因此對(duì)魚體內(nèi)黃嘌呤的代謝需要進(jìn)一步研究。

圖9表示內(nèi)臟中總嘌呤含量變化，結(jié)果表明4 ℃冷藏的內(nèi)臟中嘌呤總含量較穩(wěn)定，流水解凍樣品在第7 天時(shí)總嘌呤含量減少，可能的原因是解凍過程中水分進(jìn)入內(nèi)臟導(dǎo)致嘌呤相對(duì)含量降低。研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠抑制酶活力，從而減緩嘌呤分解速度[22]，這也可能是內(nèi)臟中嘌呤含量增加的原因之一。

圖6 魚肉中的總嘌呤變化Fig.6 Total purine changes in the meat of fish

圖7 背部皮中總嘌呤含量變化Fig.7 Total purine changes in fish’s dorsal skin

圖8 腹部皮中總嘌呤含量變化Fig.8 Total purine changes in the abdominal skin of fish

圖9 內(nèi)臟中總嘌呤含量變化Fig.9 Total purine changes in the viscera of fish

2.8 不同條件下魚肉中4 種嘌呤堿基含量變化

大菱鲆魚肉是其主要可食用部分，了解不同貯藏溫度和解凍條件下嘌呤含量變化，有助于對(duì)冷藏時(shí)間進(jìn)行控制，避開高嘌呤含量的時(shí)間段食用。如圖10所示，4 ℃冷藏的魚肉中，嘌呤總含量呈先增后減的趨勢(shì)，變化最顯著的是次黃嘌呤和黃嘌呤。第0 天的魚肉中未檢測(cè)出黃嘌呤，而冷藏7 d 后，黃嘌呤含量升高，可以推測(cè)其產(chǎn)生的主要階段是魚體死后的貯藏階段。

圖10 4 ℃冷藏條件下魚肉中4 種嘌呤變化情況Fig.10 Changes of four purines in the meat of frozen fish at 4°C

圖11 流水解凍魚肉中4 種嘌呤含量變化Fig.11 Change of four purines in the meat of fish by way of flowing water

圖12 40 ℃解凍條件下魚肉中4 種嘌呤變化Fig.12 Changes of 4 purines in fish under thawing conditions at 40°C

由圖11～12 可知，第7 天可檢測(cè)出黃嘌呤，且黃嘌呤含量低于其它3 種嘌呤，第14 天未檢測(cè)出黃嘌呤，可能是由于流水解凍使得嘌呤隨著水分流失，致使測(cè)得含量減少。4 種嘌呤中次黃嘌呤含量較高，可能的原因是在低溫環(huán)境下，魚肉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組織對(duì)Ca2+的吸收能力下降，使肌漿纖維內(nèi)部的Ca2+濃度增加，Mg2+-ATP 酶被Ca2+離子激活，從而使ATP 加速降解[23]，ATP 的一系列代謝會(huì)最終生成次黃嘌呤，致使次黃嘌呤含量上升。此外，經(jīng)-18 ℃冷凍以及40 ℃溫水浸泡解凍的魚肉中黃嘌呤含量比流水解凍的魚肉黃嘌呤含量高，推測(cè)溫度與黃嘌呤生成有關(guān)。研究表明，黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝中的關(guān)鍵酶，其可催化次黃嘌呤向黃嘌呤轉(zhuǎn)化。黃嘌呤氧化酶的最適溫度為35 ℃左右[24-25]，低溫抑制了黃嘌呤氧化酶的反應(yīng)活力，從而致使黃嘌呤含量降低。對(duì)比4 ℃貯藏的魚肉，流水解凍的魚肉中黃嘌呤含量較低也可進(jìn)一步證實(shí)低溫抑制黃嘌呤產(chǎn)生的推論。此外，對(duì)比圖10和圖11發(fā)現(xiàn)，-18 ℃冷凍的魚肉在第7 天檢測(cè)出的次黃嘌呤含量低于4 ℃貯藏的魚肉，推測(cè)貯藏溫度對(duì)次黃嘌呤有影響。經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，不同貯藏溫度對(duì)次黃嘌呤含量的變化具有顯著影響。溫度越低，次黃嘌呤增加的速度越慢[26]。大菱鲆魚肉是其主要可食用部分，了解不同貯藏溫度和解凍條件下嘌呤含量變化，有助于對(duì)冷藏時(shí)間進(jìn)行控制，避開高嘌呤含量時(shí)間段食用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法探究了不同甲醇配比對(duì)4 種嘌呤分離效果的影響，并確定最適流動(dòng)相。檢測(cè)了新鮮大菱鲆各部位的嘌呤含量，結(jié)果顯示，魚肉中的嘌呤含量低于大菱鲆魚皮和內(nèi)臟，新鮮魚肉中嘌呤含量為44.3853 mg/100 g，相較其它可食用部分，魚肉中的嘌呤含量最低。對(duì)冷藏和解凍方式進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，流水解凍在一定程度上抑制了黃嘌呤的生成，采用該方式解凍的魚肉中黃嘌呤含量比溫水解凍的魚肉嘌呤含量低。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉中的總嘌呤含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，魚皮中總嘌呤含量隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，經(jīng)過冷藏的魚肉嘌呤含量高于新鮮魚肉的嘌呤含量。因此為了降低高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)病率，建議消費(fèi)者食用新鮮魚肉或在-18 ℃冷凍條件下貯藏的魚肉。