香芹酚對食源糞腸球菌生物膜形成的抑制作用

靳盼盼 劉亞文 邵美麗 劉 芳 孫芝蘭 吳海虹 許曉曦

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）長期以來被認為是哺乳動物腸道無害共生菌，然而近20年的研究表明，該菌是主要的臨床感染病原體，可以引發(fā)心內(nèi)膜炎、尿路感染及傷口感染等多種疾病，檢出率僅次于大腸桿菌[1-2]。在食品中作為食源性腐敗菌，因其對外界適應(yīng)能力強，耐受性強，且具有很強的生物膜形成能力，使食品在貯存與分銷過程中容易發(fā)生交叉污染、腐敗的現(xiàn)象，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，造成經(jīng)濟損失。在食品生產(chǎn)過程中，當腐敗菌以生物膜形式存在時，由于生物膜為細菌生長提供天然屏障，所以使其不易消除，對外界環(huán)境耐受性強且會固著在食品機械設(shè)備表面，從而成為后續(xù)食品流通過程中潛在的污染源[3-6]。Sharma等[7]對引起滅菌乳產(chǎn)品腐敗和相關(guān)疾病的腐敗菌和病原菌進行溯源檢測，在產(chǎn)品加工過程中的接觸表面和設(shè)備表面檢測到相應(yīng)腐敗菌和病原菌形成的生物膜，表明生物膜的形成對食品安全和衛(wèi)生形成隱患。

近年來，有研究表明植物精油成分可抑制細菌生物膜的形成等微生物特性[8-11]。精油中的一些成分可以影響細菌形成生物膜的初始粘附，生物膜胞外基質(zhì)的合成，細菌的群體感應(yīng)等，被認為是抑制生物膜形成的主要機制[12-13]。香芹酚是牛至和百里香等植物精油的主要成分，低劑量的香芹酚可以降低細菌的運動和侵襲性，減少金黃色葡萄球菌和沙門氏菌菌株生物膜的形成[13-14]。Burt 等[15]研究表明香芹酚在亞抑菌濃度下可以破壞紫色桿菌細菌群體感應(yīng)，有效抑制細菌生物膜的形成，減少紫色色桿菌素產(chǎn)物和幾丁質(zhì)酶的活性，然而對已形成的生物膜無明顯作用。目前有關(guān)香芹酚對糞腸球菌及其生物膜抑制方面的研究較少，本研究以從低溫肉制品中分離的優(yōu)勢腐敗菌糞腸球菌為對象，首先研究香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生長的影響，然后通過分析亞抑菌濃度下的香芹酚對生物膜內(nèi)菌落總數(shù)、菌體泳動能力、生物膜胞外多糖含量的影響，利用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜的微觀結(jié)構(gòu)狀態(tài)，最后用熒光定量PCR 分析相關(guān)基因表達量變化，研究香芹酚對其生物膜形成的抑制作用和可能機制，為開發(fā)低溫食品防腐保鮮技術(shù)和優(yōu)化安全衛(wèi)生檢測標準提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株和材料

糞腸球菌R612-Z1，本實驗室從鹽水鴨中分離并保存。香芹酚（純度＞99%），湖北鑫潤德化工有限公司；腦心浸液（Brain Heart Infusion）培養(yǎng)基，北京陸橋；24 孔細胞培養(yǎng)板，美國康寧；總RNA 提取試劑盒，北京天根；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物；NuncTMLab-TekTM8 孔腔室蓋玻片、LIVE/DEAD Bac LightTM細胞活性測定試劑盒，美國賽默飛。

1.2 儀器與設(shè)備

掃描電子顯微鏡，德國蔡司；PE 激光共聚焦顯微鏡，美國鉑金埃爾默；實時熒光定量PCR 儀，美國羅氏；5810 高速離心機、核酸蛋白測定儀，德國艾本德；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，中國知楚。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng) 將糞腸球菌R612-Z1 接種于無菌腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）中，培養(yǎng)至對數(shù)期時，接種環(huán)蘸取少量菌液在BHI 固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單一菌落到含有5 mL BHI 液體培養(yǎng)基的試管中振蕩過夜，制備凍存菌液（40%甘油），存放在-40 ℃冰箱中備用。每次試驗前，凍存甘油菌按照1%比例接種到對應(yīng)培養(yǎng)基，過夜活化。細菌培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r/min。

1.3.2 香芹酚對糞腸球菌的最小抑菌濃度（MIC）的測定 按照二倍稀釋法測定香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 的最小抑菌濃度，將活化好的菌液1%接種到5 mL 新鮮BHI 培養(yǎng)基并加入香芹酚，菌液和香芹酚按比例混合，使其香芹酚最終的質(zhì)量濃度為1 024，512，256，128，64，32，16，8 μg/mL，對照組為未加入香芹酚的菌液。37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。首先肉眼觀察渾濁度，香芹酚的質(zhì)量濃度小，試管內(nèi)澄清的質(zhì)量濃度可推測為最小抑菌濃度，每個梯度的試管中取200 μL 液體到96 孔板中，于600 nm 波長處測定吸光度，以無菌生長的最低香芹酚濃度為MIC。

1.3.3 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生長的影響按1.3.2 方法制備含各梯度香芹酚的菌液后，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h 振蕩均勻后，在96孔板中依次加入200 μL 各梯度菌液混合物，于600 nm 波長處測定吸光度，繪制細菌生長曲線，分析不同濃度的香芹酚對菌株生長的影響。

1.3.4 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 泳動能力的影響 采用軟瓊脂平板法[16-18]測定香芹酚對其泳動能力（swimming 和swarming）的影響，首先準備swimming 培養(yǎng)基（10%胰蛋白胨、5%氯化鈉、2.5%葡萄糖和0.3%瓊脂）；swarming 培養(yǎng)基（10%胰蛋白胨、5%氯化鈉、10%酵母膏、0.5%葡萄糖和0.5%瓊脂）。高溫蒸汽滅菌并冷卻至適宜溫度后加入香芹酚，使其最終濃度為1/4 MIC、1/8 MIC，對照組為未加入香芹酚的軟瓊脂平板。取過夜活化后的菌液按照1%接種到BHI 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液離心，12 000 r/min，5 min，移除上清液，將菌泥用0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH=7.4） 洗滌3次后，紫外分光光度計于600 nm 波長處調(diào)節(jié)吸光度為0.8～1.0，轉(zhuǎn)移3 μL 菌懸液滴加到軟瓊脂平板的中心，將swimming 軟瓊脂平板和swarming 軟瓊脂平板分別靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h 和20 h 后，測定并記錄細菌在兩種平板上的擴散直徑。

1.3.5 香芹酚對糞腸球菌生物膜形成的影響

1） 生物膜內(nèi)菌數(shù)的測定 按1.3.2 節(jié)的方法制備各梯度含香芹酚的菌液后，依次加入梯度為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 的菌液到24 孔細胞培養(yǎng)板中，對照組為不加香芹酚的菌液，每孔1 mL 菌液，分別在12，24，48，72 h 對每孔生物膜中進行菌落測定。在待測時間點，首先將上層培養(yǎng)基吸出，每孔加入1 mL 0.1 mol/L 無菌PBS 緩沖液（pH=7.4）洗滌2 次后，加入1 mL 生理鹽水并使用無菌棉簽擦拭細胞培養(yǎng)孔，確?？變?nèi)的生物膜被全部擦除，將棉簽和孔內(nèi)液體加入含有9 mL 生理鹽水的試管中，渦旋振蕩5 min，使棉簽上附著及生物膜內(nèi)包裹的細菌充分游離到液體中[19]。按照梯度稀釋法將試管內(nèi)液體稀釋后，吸取稀釋液，涂布均勻后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)24 h 后菌落計數(shù)。

2） 生物膜胞外多糖的含量測定 按1.3.2 節(jié)的方法制備含有不同梯度香芹酚的菌液，對照組為不加香芹酚的菌液，每孔1 mL 菌液，培養(yǎng)生長至12，24，48，72 h 的生物膜，移除上層培養(yǎng)基并洗滌后每孔加入1 mL 無菌PBS 溶液，沖洗細胞培養(yǎng)孔，收集孔內(nèi)懸濁液，5 000×g，4 ℃離心20 min，收集菌泥，將菌泥重懸于含有0.22%甲醛的0.85%NaCl 水溶液中，先將菌懸液置于80 ℃水浴鍋加熱30 min，放入低溫離心機15 000×g，4 ℃離心30 min，離心收集上清[20]。使用苯酚-硫酸法測定生物膜胞外多糖的含量[21]。

1.3.6 香芹酚對糞腸球菌生物膜微觀狀態(tài)的影響

1） 掃描電鏡（SEM）觀察 SEM 可以觀察到生物膜內(nèi)菌體聚集狀態(tài)，從而探究生物膜的成熟程度不同對膜內(nèi)細菌狀態(tài)的影響。按上述1.3.2 節(jié)的方法配制含有不同梯度香芹酚的菌液，對照組為不加香芹酚的菌液。在NuncTMLab-TekTM8 孔腔室載玻片培養(yǎng)板中每孔加入400 μL 菌液，在試驗進行期間每24 h 更換上層培養(yǎng)基以確保細菌生長條件，分別在生物膜培養(yǎng)至12，24，48，72 h取樣。樣品具體處理參見1.3.5 節(jié)，無菌PBS 溶液洗滌并晾干后，去掉上層隔板，按照樣品分區(qū)切割載玻片，放入4 ℃冰箱中使用2.5%戊二醛溶液固定12 h，室溫自然晾干后使用1%鋨酸溶液固定90 min，然后依次用體積分數(shù)為30%，50%，80%，90%，100%的乙醇梯度脫水10 min[21]，最后使用100%叔丁醇洗滌完畢。玻片用于SEM 觀察前噴金處理，圖片放大倍數(shù)為5 000 倍[22]。

2） 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察 CLSM可以觀察到生物膜在成熟期間的厚度變化。按

1.3.2 節(jié)的方法制備含有不同梯度香芹酚的菌液，對照組為不加香芹酚的菌液。在NuncTMLab-TekTM8 孔腔室培養(yǎng)板中每孔加入400 μL 菌液，在試驗進行期間每24 h 更換上層培養(yǎng)基以確保細菌生長條件，分別在生物膜培養(yǎng)至12，24，48，72 h 取樣。樣品具體處理參見1.3.5 節(jié)，無菌PBS溶液洗滌2 次并室溫晾干后，參考LIVE/DEAD Bac LightTM細胞活性測定試劑盒說明書對生物膜進行染色處理。處理后的樣品可以在-20 ℃避光保存[22-23]。使用CLSM 觀察生物膜的厚度，根據(jù)試劑盒中配制的熒光染料探針SYTO-9 和PI，設(shè)置觀察參數(shù)，其中SYTO-9 和PI 的激發(fā)波長為485，535 nm；發(fā)射波長為498，637 nm，使用60 倍油鏡觀察視野下的生物膜狀態(tài)。

1.3.7 香芹酚對糞腸球菌生物膜菌體內(nèi)相關(guān)基因表達量的影響 按1.3.2 節(jié)的方法制備處理組為1/4 MIC 香芹酚菌液，對照組為不加香芹酚的菌液，選取培養(yǎng)至24 h 的生物膜，培養(yǎng)方法和前處理方法參考1.3.5 節(jié)的方法，確?？變?nèi)生物膜完全被收集，12 000×g，4 ℃低溫離心2 min，收集菌泥，根據(jù)天根生物RNA 提取試劑盒說明書方法提取菌體總RNA，并迅速按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系和條件按照說明書推薦設(shè)置。表1為熒光定量PCR 引物。為了評估與生物膜形成相關(guān)目標基因的相對表達變化采用2-△△Ct法分析試驗數(shù)據(jù)，其中△△Ct=Ct處理組（Ct目標基因-Ct管家基因）-Ct對照組（Ct目標基因-Ct管家基因），以log2（2-△△Ct）＞1 或log2（2-△△Ct）＜-1 作為基因高表達的評價標準。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗過程中涉及的試驗重復(fù)3 次，平行2次。使用SPSS 17.0 處理試驗數(shù)據(jù)并采用ANOVA進行Dunett T3 差異分析，以平均值和標準差表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 的最小抑菌濃度（MIC）

根據(jù)對糞腸球菌R612-Z1 生長情況的肉眼觀察，以及測定的培養(yǎng)物的OD600值，確定香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 的最小抑菌質(zhì)量濃度為512 μg/mL。

2.2 不同質(zhì)量濃度香芹酚處理下糞腸球菌R612-Z1 的生長曲線

由圖1可知，糞腸球菌R612-Z1 在香芹酚處理質(zhì)量濃度為512 μg/mL 時，細菌生長被抑制，而當處理質(zhì)量濃度為256 μg/mL 時，細菌前12 h 的生長過程被抑制，12 h 后與對照組基本重合；128 μg/mL 香芹酚處理時，4 h 前生長速度略低于對照組，之后與對照組生長曲線重合，最大生長量相同；64 μg/mL 香芹酚處理和對照組的生長曲線重合，因此接下來的試驗中主要采用質(zhì)量濃度為128 μg/mL 以及64 μg/mL 的香芹酚處理，探究其

對生物膜的抑制影響。

圖1 不同香芹酚濃度下糞腸球菌R612-Z1 生長曲線Fig.1 Growth inhibition of E.faecalis R612-Z1 cells in carvacrol solutions at different concentrations

2.3 香芹酚對糞腸球菌涌動能力的抑制

細菌生物膜形成初期主要依靠鞭毛的泳動能力，使得菌體移動到附著材料表面，然后在菌毛的作用下粘附固著，形成生物膜[25-26]。菌體的泳動能力分為兩種，swarming 代表一種群體菌體運動行為，swimming 代表一種單一菌體運動行為。如圖2所示，當香芹酚的處理質(zhì)量濃度分別為128 μg/mL和64 μg/mL 時，對細菌的泳動能力（swimming）和叢動能力（swarming）有明顯的抑制作用（P＜0.05），而不同處理濃度之間無顯著差異（P＞0.05）。由于鞭毛所參與的泳動對生物膜的早期形成起關(guān)鍵作用，此結(jié)果表明香芹酚可能會通過影響生物膜早期形成時菌體的初期粘附能力來抑制生物膜的形成。

圖2 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 泳動能力的抑制作用Fig.2 Inhibition of surge capacity of E.faecalis R612-Z1 by carvacrol

2.4 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜形成的影響

2.4.1 生物膜內(nèi)菌數(shù)的變化 圖3為不同香芹酚濃度下生物膜內(nèi)菌體數(shù)量的變化。糞腸球菌R612-Z1 12 h 形成的生物膜內(nèi)活菌總數(shù)比其它培養(yǎng)時間內(nèi)活菌總數(shù)略低，這與生物膜成熟時間有關(guān)，此時生物膜并未完全成熟。24 h 后生物膜內(nèi)活菌總數(shù)基本保持一致，說明生物膜已經(jīng)成熟，并且處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài)。在選取的4 個時間點內(nèi)，處理組和對照組的活菌總數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），說明質(zhì)量濃度在128，64 μg/mL 下的香芹酚對生物膜內(nèi)活菌總數(shù)沒有顯著影響。

2.4.2 生物膜內(nèi)胞外多糖含量的變化 從生物膜的大量研究中發(fā)現(xiàn)，胞外多糖在維持細菌生物膜的三維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮不可替代的作用，作為生物膜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，進而成為功能的主要承擔者[25，27]。因此，為抑制生物膜的形成，主要的研究思路即為抑制或減少胞外多糖的合成和分泌。通過苯酚-硫酸法測定糖濃度-吸光度線性關(guān)系為y=0.0086x+0.0753（R2=0.99），可以進行后期多糖的含量測定。如圖4a 所示，對照組和處理組生物膜胞外多糖含量都隨培養(yǎng)時間的延長而增加，說明菌體會持續(xù)合成胞外多糖來形成穩(wěn)定的生物膜結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)12 h 時，處理組與對照組胞外多糖含量無顯著差異（P＞0.05），128 μg/mL 與64 μg/mL 處理組對糞腸球菌R612-Z1 生物膜胞外多糖抑制率分別為4.8%和8.13%，此時為糞腸球菌R612-Z1 生物膜形成的初期階段，胞外多糖分泌含量較低；培養(yǎng)24 h 后，雖然兩個處理組之間胞外多糖含量無顯著差異（P＞0.05），對糞腸球菌R612-Z1 生物膜胞外多糖抑制率分別為20.29%和20.34%，但是都顯著低于對照組的胞外多糖含量（P＜0.05）；培養(yǎng)48 h 后，128 μg/mL 胞外多糖含量顯著低于64 μg/mL處理組（P＜0.05），對糞腸球菌R612-Z1 生物膜胞外多糖抑制率分別為30.98%和20.03%；培養(yǎng)72 h后，128 μg/mL 處理組顯著低于對照組（P＜0.05），抑制率較48 h 時下降為22.97%。而64 μg/mL 處理組與對照組無顯著差異（P＞0.05），此時抑制率為5.16%。

圖3 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜內(nèi)菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of carvacrol on the bacterial counts in Enterococcus faecalis R612-Z1biofilm

圖4 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜胞外多糖合成的影響Fig.4 Effect of carvacrol on extracellular polysaccharide production of E.faecalis R612-Z1 biofilm

2.5 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜微觀狀態(tài)的影響

2.5.1 SEM 觀察生物膜內(nèi)菌體聚集后的微觀狀態(tài)

如圖5所示，使用SEM 觀察糞腸球菌R612-Z1生物菌膜內(nèi)菌體的聚集狀態(tài)，培養(yǎng)12 h 后，菌體單層粘附于表面無細菌聚集體形成，隨培養(yǎng)時間的延長，菌體之間出現(xiàn)聚集聯(lián)結(jié)，與同一時間對照組相比，經(jīng)過128 μg/mL 香芹酚處理的糞腸球菌R612-Z1 生物膜，細胞個體形態(tài)無明顯變化，細胞之間連接不致密，細胞層數(shù)變薄。

圖5 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜菌體聚集狀態(tài)的影響（5 000×）Fig.5 Effect of caracol on cell aggregation in E.faecalis R612-Z1 biofilm （5 000×）

2.5.2 CLSM 觀察生物膜成膜厚度的變化 通過CLSM 觀察在生物膜成熟過程中糞腸球菌R612-Z生物膜成膜厚度及結(jié)構(gòu)的變化，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)未添加香芹酚的對照組生物膜隨著生物膜的不斷成熟，生物膜厚度逐漸增加，生物膜結(jié)構(gòu)之間越來越緊密，而在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，處理組與對照組之間有明顯差異，處理組生物膜厚度相對較低，并且生物膜之間有明顯裂縫、凹凸不平，生物膜結(jié)構(gòu)相對松散、不致密。

圖6 香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜成膜厚度的影響Fig.6 Effect of carvacrol on the thickness of Enterococcus R612-Z1 biofilm

2.6 香芹酚對糞腸球菌生物膜菌體內(nèi)相關(guān)基因表達量的影響

對照組與128 μg/mL 香芹酚處理組生物膜菌體內(nèi)各目標基因的表達量變化如圖6所示，培養(yǎng)24 h 后，對照組生物膜菌體中的14 種目標基因的表達量顯著低于對照組生物膜菌體中的基因表達量（log2（2-△△Ct）＜-1）；ebpR、ebpA、ebpC 是參與生物膜形成初期粘附的相關(guān)基因，epaA～epaR 則是參與生物膜成熟過程中胞外多糖合成的基因，這些與生物膜形成相關(guān)的表達基因均出現(xiàn)顯著下調(diào)，結(jié)合上述香芹酚處理之后生物膜的表觀變化，兩者之間的相互一致說明香芹酚可以抑制生物膜形成并可能主要通過兩個方面發(fā)揮作用，一方面是影響生物膜初始粘附，另一方面是減少胞外多糖的合成。

圖7 糞腸球菌R612-Z1 生物膜內(nèi)菌體細胞內(nèi)相關(guān)基因表達量變化Fig.7 Changes of relative expression levels of biofilm-related genes in E.faecalis R612-Z1

3 結(jié)論

近年來，隨著人們對食品安全問題的重視，關(guān)于尋求安全的天然提取物來抑制生物膜形成的研究越來越多。丁榮榮等[28]研究提出大蒜提取物通過干擾銅綠假單胞菌PAO1 群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制其生物膜的形成，降低與生物膜形成相關(guān)特性的表達。朱軍莉等[29]研究表明茶多酚和葡萄籽提取物在亞抑菌濃度下表現(xiàn)出較強的抗銅綠假單胞菌生物被膜作用，主要通過影響假單胞菌初期的粘附。本試驗選取亞抑菌濃度香芹酚處理糞腸球菌R612-Z1 形成的生物膜，發(fā)現(xiàn)香芹酚在亞抑菌濃度下對糞腸球菌R612-Z1 生物膜有明顯的抑制作用，該濃度下糞腸球菌生物膜內(nèi)活菌總數(shù)與對照組無顯著差異，說明香芹酚對生物膜活菌無影響，不會增加菌體的抗逆性；SEM 和CLSM 觀察發(fā)現(xiàn)香芹酚存在時生物膜結(jié)構(gòu)松散，細胞之間連接不致密，膜厚度降低并且有裂縫、不平整；菌體泳動試驗和與粘附相關(guān)基因的表達量變化結(jié)果表明香芹酚會影響生物膜形成初期菌體的粘附能力；胞外多糖含量定量檢測和該合成基因簇中相關(guān)基因表達量的變化說明香芹酚能夠明顯抑制生物膜成熟階段胞外多糖的合成。本研究結(jié)果說明亞抑菌濃度香芹酚對糞腸球菌R612-Z1 生物膜有明顯的抑制作用，其作用主要通過抑制菌體的初期粘附和胞外多糖的合成來完成，然而有關(guān)香芹酚如何通過影響菌體內(nèi)的調(diào)控因子來調(diào)控粘附和多糖合成過程仍需進一步研究。