包頭地區(qū)仔豬源致瀉性大腸桿菌進(jìn)化分群、生物被膜形成能力及耐藥性檢測(cè)

葛海燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 內(nèi)蒙古 包頭 014100)

仔豬腹瀉是臨床中常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，引起仔豬腹瀉病原較多，主要包括大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等，其中致病性大腸桿菌是引發(fā)仔豬腹瀉的重要病原之一[1-3]。細(xì)菌生物被膜(Bacterial biofilm, BBF) 是組成結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落的主要物質(zhì)，主要由附著細(xì)菌細(xì)胞和包裹細(xì)菌的水合性胞外聚合物物質(zhì)，在自然界中，當(dāng)外界條件成熟，細(xì)菌均能夠形成生物被膜(Biofilm，BF)，生物被膜形成能力與細(xì)菌毒力及耐藥性具有一定相關(guān)性[4-5]。仔豬大腸桿菌病的防治主要以抗菌藥物為主，長(zhǎng)期使用抗菌藥物，會(huì)致使大腸桿菌多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，降低抗菌藥物使用效果，同時(shí)也給人們健康帶來(lái)一定威脅[6-7]。

本試驗(yàn)以臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)并分析其進(jìn)化分群、生物被膜形成能力、耐藥性及其相關(guān)性，為科學(xué)中合理用藥及防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 2018-2019年，臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌、大腸桿菌質(zhì)控菌株 ATCC 25922均由本單位動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試驗(yàn)材料 營(yíng)養(yǎng)肉湯，購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；臨床中常用藥物紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，購(gòu)自上海研晶生物科技有限公司；2×TaqMarker Mix，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL-600 Marker，購(gòu)自北京中科瑞泰生物公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；常規(guī)的試驗(yàn)試劑由本試驗(yàn)提供。

1.3 細(xì)菌的復(fù)蘇與培養(yǎng) 取出-80 ℃保存的菌種，室溫解凍，無(wú)菌條件劃線接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 細(xì)菌分子分群PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[8]，設(shè)計(jì)大腸桿菌分子分群chuA、yiaA和TspE4.C2引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌株的基因組DNA，采用多重PCR方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)分群鑒定，大腸桿菌系統(tǒng)分群進(jìn)化判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)圖1。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMarker 12.5 μL，引物P1、P2各1 μL，DNA模板1 μL，去離子水9.5 μL。94 ℃預(yù)變性 5 min; 94 ℃變性 30 s, 57.5 ℃復(fù)性 30 s, 72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán);最后 72 ℃延伸 5 min。將擴(kuò)增后的 PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖上凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

圖1 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群的判定標(biāo)準(zhǔn)

表1 大腸桿菌分子分群引物序列

1.5 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)檢測(cè) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)法進(jìn)行操作和試驗(yàn)結(jié)果判斷，以大腸桿菌 ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。調(diào)整分離菌株的濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，無(wú)菌條件下均勻涂布在普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量其抑菌圈直徑(mm)。

1.6 細(xì)菌的BF 檢測(cè) 按參考文獻(xiàn)[9]，采用結(jié)晶紫微孔板法對(duì)臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進(jìn)行 BF形成能力測(cè)定。每株菌重復(fù)接種 10孔，在OD值595 nm下，重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)孔和對(duì)照孔3 次，取均值。判定標(biāo)準(zhǔn)以陰性對(duì)照孔OD值的2倍作為判斷能否形成 BF 的臨界點(diǎn)ODc值，當(dāng)OD值≤ODc值時(shí)，表示BF形成能力為0；當(dāng)ODc值

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分子分群鑒定 分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌均擴(kuò)出來(lái)chuA、yiaA和TspE4.C2目的條帶。經(jīng)結(jié)果判定，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中，A群有8株、B1群有9株、B2群有17株、D群有12株，分別占分離菌株的16.7%、18.8%、35.4%、25.0%， 其中， B2群和D群流行為主(表2)。

表2 仔豬源致瀉性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定結(jié)果

2.2 耐藥性檢測(cè) 由表3可知，分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素、氟苯尼考、恩諾沙星7種藥物耐藥性較高，耐藥率在58.3%～100.0%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、林可霉素、大觀霉素5種藥物耐藥性相對(duì)較低，耐藥率在11.9%～31.3%。

表3 仔豬源致瀉性大腸桿菌的耐藥性分析結(jié)果

2.3 BF形成能力檢測(cè) 采用結(jié)晶紫微孔板法對(duì)臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌進(jìn)行 BF形成能力測(cè)定。臨床分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中43株能形成BF，占分離菌株的89.6%(43/48)。其中，強(qiáng)形成膜能力菌株有 20株、中形成膜能力菌株有16株、弱形成膜能力菌株有7株、不形成BF菌株的有5株，分別占分離菌株的41.7%、33.3%、14.6%、10.4%。

2.4 BF形成能力與耐藥性相關(guān)性分析 由表4可知，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與強(qiáng)形成BF菌株的復(fù)合率在60.0%～100%，多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性與中形成BF菌株的復(fù)合率在56.3%～93.8%，多粘菌素、新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林5種藥物耐藥性與強(qiáng)形成BF菌株的復(fù)合率在57.1%～100%。其余的抗菌藥物的耐藥性與BF形成復(fù)合率較低。說(shuō)明多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林7種藥物耐藥性產(chǎn)生與BF形成能力有關(guān)。

表4 仔豬源致瀉性大腸桿菌耐藥性與BF形成能力相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

已有報(bào)道表明，大腸桿菌可分為 A、B1、B2 和 D 四個(gè)群，其中 B2 和 D 群被認(rèn)為是主要的致病群[8-9]。研究表明，分離的致犬腹瀉性大腸桿菌分離株以B2、D群為主。本試驗(yàn)表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌中以B2群和D群流行為主，分別占分離菌株的35.4%和25.0%，與王明誠(chéng)等[10]報(bào)道的基本上一致。但與李金朋等[9]報(bào)道具有一定的差異性，可能與地區(qū)有關(guān)。

大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生與抗菌藥物長(zhǎng)期使用有關(guān)，還與其攜帶的耐藥機(jī)制有關(guān)，其攜帶耐藥質(zhì)粒在不同菌株之間傳播，引起其他菌株產(chǎn)生耐藥性[11]。本試驗(yàn)表明，該地區(qū)分離的48株仔豬源致瀉性大腸桿菌對(duì)抗菌藥物耐藥性嚴(yán)重。與計(jì)徐等[12]、王克領(lǐng)等[13]的報(bào)道存在一定差異性?？赡芘c地區(qū)、菌株耐藥性遺傳及臨床用藥不同，導(dǎo)致仔豬大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性存在一定的差異性。本試驗(yàn)表明，48株仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與多黏菌素、新霉素、磺胺間甲氧嘧啶等7種藥物耐藥性存在一定的相關(guān)性，說(shuō)明仔豬源致瀉性大腸桿菌的BF 形成能力與其產(chǎn)生的耐藥性有關(guān)，其BF形成能力增加大腸桿菌的耐藥性。與李金朋等[9]報(bào)道基本上一致。BF形成能力增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)為該地區(qū)仔豬源致瀉性大腸桿菌病臨床合理用藥提供了試驗(yàn)依據(jù)。