豬CR1-like蛋白酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

賈瑞璞 ， 凌小雅 ， 孫雨晨 ， 尹 偉 ， 范闊海 ， 孫 娜 ， 孫耀貴 ， 李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山西 太谷 030801)

以補體受體Ⅰ型(Complement receptor 1，CR1)為基礎(chǔ)的紅細胞免疫粘附是人紅細胞最重要的免疫功能。非人靈長類動物的紅細胞免疫粘附受體是一種分子量相對較小的蛋白，稱作CR1-like。獸醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多禽類[1～2]、嚙齒類[3]、靈長類[4]等動物疾病過程中都存在紅細胞免疫功能的變化。1983年，以狒狒和恒河猴作為研究對象，證實了靈長類動物的紅細胞可以在體內(nèi)循環(huán)中攔截補體固定的免疫復(fù)合物(Immune complex，IC)，粘附著IC的紅細胞將其運送至肝臟并返回至循環(huán)系統(tǒng)中，這種紅細胞-IC的清除機制在IC沉積介導(dǎo)的疾病中是至關(guān)重要的[5]。本實驗室前期研究工作證實，豬紅細胞也具有免疫粘附功能，豬紅細胞CR1-like可粘附血清致敏的熒光大腸桿菌，并通過免疫沉淀技術(shù)進一步對豬紅細胞膜總蛋白分析發(fā)現(xiàn)，CR1-like是豬紅細胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)[6-8]。

但總體而言，豬的紅細胞雖然具有免疫功能，但是豬紅細胞發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)及其結(jié)構(gòu)特征尚不清楚，豬紅細胞轉(zhuǎn)移遞呈IC的機制研究近乎空白，為了深入研究豬紅細胞免疫粘附的分子學(xué)基礎(chǔ)，本試驗構(gòu)建了CR1-like基因的酵母雙雜交誘餌載體，并且對誘餌質(zhì)粒進行了自激活和毒性檢測，為利用酵母雙雜交技術(shù)進一步研究CR1-like發(fā)揮免疫粘附功能的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑 酵母菌株Y2HGold、誘餌載體pGBKT7、酵母培養(yǎng)基、X-α-Gal、金擔子素(Aureobasidia A，Aba)、Yeast Marker Yeast Transformation system 2、Yeast Protein Extraction Reagent酵母總蛋白提取試劑盒，均購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細胞，購自北京天根生化科技有限公司；c-Myc單克隆抗體，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit膠回收試劑盒，均購自O(shè)mega公司；NcoI、BamH I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase連接酶、Kanamycin，均購自Solarbio公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)本實驗室已經(jīng)篩選出的CR1-like序列CCP36和CCP811片段，使用在線軟件Prime Premier 5設(shè)計引物，在上游引物和下游引物分別增加限制性內(nèi)切酶BamH I和NcoI位點。送往北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。序列見表1。

表1 本試驗所用引物序列

2.2 基因的擴增 以本實驗室構(gòu)建保存的CCP36和CCP811質(zhì)粒為模板，利用合成的特異性引物進行PCR擴增，PCR擴增體系為20 μL：Master Mix 10 μL，模板質(zhì)粒1 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase Free H2O 7.4 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，CCP36 66.6 ℃退火1 min,40個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min(CCP811退火溫度為63.1 ℃)。將PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，電壓75 V電泳60 min，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，切下符合預(yù)期大小DNA片段進行膠回收和純化，獲得目的基因。

2.3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36及pGBKT7-CR1-like811的構(gòu)建 將電泳鑒定正確且純化后的PCR產(chǎn)物與載體pGBKT7用NcoI和BamH I雙酶切，建立20 μL雙酶切體系：NcoI 1 μL，BamH I 1 μL，10×H Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物與載體pGBKT7各1 μg，ddH2O補齊至20 μL。37 ℃反應(yīng)3 h。將反應(yīng)液進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切是否成功，將符合預(yù)期大小的目的基因及載體片段進行膠回收和純化，獲得酶切后的CR1-like片段與載體pGBKT7。

酶切后進行連接，連接體系為10 μL：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，載體pGBKT7 1 μL，CR1-like片段7 μL。移液槍輕輕混勻后，4 ℃連接12 h，得到pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811重組質(zhì)粒。

將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，利用pGBKT7卡那霉素(Kana)抗性篩選陽性克隆。挑取單個陽性菌落接種于含有50 μg/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，按照E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit I試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒。使用BamH I和NcoI對重組質(zhì)粒進行雙酶切，建立10 μL雙酶切反應(yīng)體系。37 ℃酶切反應(yīng)3 h。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。將經(jīng)過酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往美吉生物公司進行測序，將鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒擴大培養(yǎng)并保存，以備后用。

2.4 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold 根據(jù)Clontech酵母手冊，采用醋酸鋰法制備感受態(tài)酵母菌Y2HGold。使用Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2試劑盒進行轉(zhuǎn)化，分別將pGBKT7空載體和重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞。取200 μL菌液涂布于含有50 μg/mL Kana的SD/-Trp選擇性培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)4 d，直至白色且大小均勻的克隆菌落出現(xiàn)。同時將pGBKT7-53+pGADT7-T陽性對照和pGBKT7-Lam+pGADT7-T陰性對照共轉(zhuǎn)化酵母菌，將菌液涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba平板上共同培養(yǎng)。

2.5 融合蛋白在酵母菌中的表達 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌后，挑取單菌落于5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。按照Yeast Protein Extraction Reagent試劑盒說明書提取酵母總蛋白，進行Western Blot檢測，使用一抗為c-Myc單克隆抗體。

2.6 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like的毒性檢測 轉(zhuǎn)化pGBKT7-CR1-like和pGBKT7空質(zhì)粒于 Y2HGold酵母感受態(tài)細胞后，分別挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5 mL SD/-Trp中培養(yǎng)。30 ℃，24 h，250 r/min。各取100 μL菌液，以0.9% NaCl進行1∶10 000稀釋，涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況、對比菌落大小及菌落數(shù)量。

2.7 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like的自激活檢測 將包含pGBKT7-CR1-like的菌液1∶10 000稀釋后涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況及菌落顏色變化。同時對比陽性組和陰性組菌落生長情況。判定標準：陽性組在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上均生長，且在SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上菌落呈藍色；陰性組在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal上生長，菌落為白色，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上不生長。

3 結(jié)果

3.1CCP36和CCP811基因擴增結(jié)果 以CCP36和CCP811質(zhì)粒為載體，以36 F、36 R和811 F、811 R為引物進行擴增，CCP36的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可在500 bp處觀察到清晰條帶，符合預(yù)期結(jié)果518 bp；CCP811可在700 bp處觀察到清晰條帶，符合預(yù)期結(jié)果738 bp(圖1)。

圖1 CR1-like基因PCR擴增電泳圖

3.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811酶切鑒定 將轉(zhuǎn)入連接產(chǎn)物的DH5α陽性克隆進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用BamH I和NcoI對重組質(zhì)粒進行酶切，如圖2得到518 bp和738 bp左右的條帶，與預(yù)期插入條帶一致，公司測序結(jié)果表明插入片段正確。

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811的雙酶切鑒定

3.3 融合蛋白的表達結(jié)果 發(fā)光液顯色后，在50kDa和64kDa之間出現(xiàn)清晰條帶。重組質(zhì)粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811在酵母細胞中成功表達蛋白。

圖3 融合蛋白的Western Blot檢測

3.4 誘餌質(zhì)粒的毒性檢驗 將pGBKT7-CR1-Like36、pGBKT7-CR1-like811和pGBKT7分別轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)后，分別涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷型平板上,30 ℃培養(yǎng)4 d，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒菌落大小和菌落數(shù)量無明顯差異(圖4)，該pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-like811誘餌質(zhì)粒不影響酵母細胞的生長，對Y2HGold酵母細胞無毒性作用。

圖4 誘餌質(zhì)粒的毒性檢測

3.5 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測 將pGBKT7-CR1-Like36、pGBKT7-CR1-Like811轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)后，分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba營養(yǎng)缺陷型平板，在SD/-Trp平板上長出白色菌落(圖5A和5D)，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上菌落不變藍(圖5B和5E)，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba營養(yǎng)缺陷型平板上無菌落長出(圖5C和5F)。說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-Like811表達的蛋白不具有自激活性，所構(gòu)建重組質(zhì)粒可用于后續(xù)試驗。

圖5 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測

如封二彩版圖6所示，陽性對照組在3個培養(yǎng)基上均生長，且在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba培養(yǎng)基上菌落呈藍色(封二彩版圖6B和6C)；陰性組只在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal上生長，在SD/-Trp/X-α-Gal/Aba上不生長(封二彩版圖6F)。

4 討論

紅細胞免疫粘附功能的變化與機體疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及其免疫狀態(tài)有高度的相關(guān)性[9]。研究證實，在阿爾茨海默氏疾病[10]、自身免疫性疾病[11]和炎癥[12]等疾病中CR1均發(fā)揮著重要作用。CR1是補體C3b、C4b的主要補體受體，表達于多種細胞表面，是一種多態(tài)性膜糖蛋白。CR1也是補體活化的調(diào)節(jié)劑，可以輔助因子I將C3b降解使其失去致炎性，抑制補體的過度活化[13]。紅細胞CR1介導(dǎo)的免疫粘附功能對評價機體天然免疫功能狀態(tài)具有十分重要的意義。在畜牧獸醫(yī)臨床應(yīng)用中，監(jiān)測動物紅細胞的免疫功能對判定動物健康狀態(tài)、疾病的發(fā)生、治療效果、轉(zhuǎn)歸等方面具有重要的診斷應(yīng)用價值。在疾病防控方面，可以通過調(diào)控豬紅細胞免疫粘附的靶點提高機體紅細胞免疫功能，增強豬對繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、圓環(huán)病毒病(PCVD)等免疫抑制性疾病的抗病能力。然而在前期的研究中，尚未對豬發(fā)揮免疫粘附功能的分子基礎(chǔ)進行研究，為了進一步了解豬紅細胞免疫粘附的分子機制，本試驗利用酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建了豬CR1-like蛋白酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒，檢測其毒性作用和自激活作用，鑒定是否符合酵母雙雜交系統(tǒng)的要求。

酵母雙雜交技術(shù)是檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效的分子生物學(xué)方法，由Fields和Song等在1989年提出[14]，是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。試驗中為了避免結(jié)果的假陽性，對酵母雙雜交誘餌載體進行自激活檢測，確保其自身不會激活轉(zhuǎn)錄因子。并且檢測了重組質(zhì)粒表達的融合蛋白是否對酵母細胞有毒性而影響蛋白間的相互作用造成假陰性結(jié)果。本試驗利用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建了豬CR1-like蛋白的酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-CR1-Like36和pGBKT7-CR1-Like811，利用pGBKT7載體自身能合成色氨酸的特點進行篩選，結(jié)果誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母菌后在缺乏Trp的培養(yǎng)基上生長出白色菌落，說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母細胞。并且通過提取酵母總蛋白，檢測到融合蛋白在酵母細胞中的表達。對比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的酵母菌落，含有重組質(zhì)粒的酵母菌落生長大小無差別，菌落數(shù)量相近，說明融合蛋白對酵母細胞無毒性作用，不影響酵母菌的正常生長。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4激活后，報告因子之一的α-半乳糖苷酶被酵母細胞表達分泌，在顯色底物X-a-Gal的存在下表現(xiàn)為藍色，激活后的酵母細胞同時也表達報告因子AUR1-C，表現(xiàn)出強的抗Aba性。含有重組質(zhì)粒的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養(yǎng)基上生長未變藍，在添加Aba的培養(yǎng)基中無菌落生長，說明融合蛋白不會單獨激活酵母細胞的轉(zhuǎn)錄啟動子，所構(gòu)建的質(zhì)粒無自激活性。綜上所述，本試驗構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811對Y2HGold酵母細胞無毒性作用，也無自激活現(xiàn)象，符合酵母雙雜交系統(tǒng)的要求，為進一步研究豬紅細胞的免疫功能及其分子機理奠定了基礎(chǔ)。