長(zhǎng)白山北部西伯利亞狍局域種群間的基因流

田玉苗 盛清宇 袁立成 姜廣順

(國(guó)家林業(yè)和草原局貓科動(dòng)物研究中心，東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

廣義的基因流是指，導(dǎo)致一個(gè)群體向另一個(gè)群體內(nèi)產(chǎn)生基因交換的所有機(jī)制的通稱。而基因遷移，即基因流，是群體間產(chǎn)生基因交換或遺傳物質(zhì)交換的某種表現(xiàn)形式[1]。因此，在群體水平或個(gè)體水平層面中，在群體或個(gè)體消亡或重建過(guò)程中所涉及的一切基因的“運(yùn)動(dòng)”或遺傳物質(zhì)的動(dòng)態(tài)交換過(guò)程，都可以統(tǒng)稱為基因流?；蛄魍ǔ１徽J(rèn)為是重要的群體分化驅(qū)動(dòng)力，來(lái)維持分化或正在分化群體間的穩(wěn)定性，使得群體適應(yīng)環(huán)境。基因流是影響群體內(nèi)部和群體之間遺傳變異程度的重要因素，也是產(chǎn)生進(jìn)化的一個(gè)重要因素。

狍(Capreolusspp.)是鹿科(Cervidae)中分布最廣泛的動(dòng)物之一，包括2個(gè)種，即體型相對(duì)較小的歐洲狍(Capreoluscapreolus)以及體型相對(duì)較大的西伯利亞狍(Capreoluspygargus)[2-3]。西伯利亞狍的主要分布區(qū)域包括整個(gè)亞洲大陸的古北界[2]及東歐的部分地區(qū)[4]。在中國(guó)，狍主要分布在北部各省份，按種類分為東北亞種、西北亞種和天山亞種。在東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)分布區(qū)域內(nèi)，也廣泛分布，是東北豹的主要獵物(占食物構(gòu)成的66%)以及東北虎的獵物之一(占食物構(gòu)成的9%)[5]。因此，研究狍種群間的基因流，對(duì)于探究獵物種群的有效恢復(fù)，對(duì)東北虎、東北豹種群的保護(hù)有著重要的意義。

目前，有相當(dāng)部分的關(guān)于歐洲狍種群基因流的研究，如Coulon等[6]研究表明，歐洲狍的基因流受景觀連通性的影響。此外，Baker等[7]使用線粒體 DNA 和微衛(wèi)星標(biāo)記的研究方法，比較了英國(guó)原有的狍種群和引入種群之間的遺傳多樣性差異以及種群混合和擴(kuò)散。Hepenstrick等[8]研究表明，在瑞士全國(guó)重要的野生動(dòng)物走廊內(nèi)，高速公路圍欄是狍基因流動(dòng)的主要障礙。而關(guān)于西伯利亞狍的種群間基因流的研究，不管在國(guó)外還是國(guó)內(nèi)都相對(duì)較少。且大多數(shù)關(guān)于西伯利亞狍的研究，多集中于西伯利亞狍種群遺傳多樣性研究，如Lee等[9]對(duì)亞洲 10 個(gè)地區(qū)西伯利亞狍的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異進(jìn)行了研究，分析了各個(gè)種群的遺傳多樣性水平，揭示了西伯利亞狍存在的3個(gè)不同地理種群。僅有盛清宇[10]使用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)研究西伯利亞狍的偏性擴(kuò)散，其結(jié)果表明西伯利亞狍的擴(kuò)散機(jī)制為偏雌擴(kuò)散。但其僅研究西伯利亞狍種群的擴(kuò)散機(jī)制，未對(duì)種群間基因流進(jìn)行研究?？偟膩?lái)說(shuō)，目前國(guó)內(nèi)利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析西伯利亞狍種群間基因流的研究基本上處于空白狀態(tài)。鑒于此，本研究試圖利用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合熒光標(biāo)記PCR技術(shù)，使用貝葉斯方法評(píng)估地理種群間的基因流，并探討長(zhǎng)白山北部西伯利亞狍局域種群間基因流對(duì)群體遺傳分化的影響，以期為管理、制定保護(hù)政策提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015—2017年，根據(jù)西伯利亞狍種群在長(zhǎng)白山北部地區(qū)地理分布范圍，選擇5個(gè)地理采樣區(qū)域(圖1)，包括張廣材嶺(ZGCL)、琿春東北虎國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(HC)、汪清國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(WQ)、穆棱林業(yè)局和天橋嶺林業(yè)局(MT)，東寧林業(yè)局(DN)。主要為冬季樣線調(diào)查或跟蹤調(diào)查時(shí)采集樣本。共收集279份糞便樣本。為了保持樣品的質(zhì)量，在提取DNA之前，糞便樣品被-80 ℃保存。

圖1 研究區(qū)域地理位置示意圖和糞便個(gè)體采樣位置Fig.1 A geographical map of the study area and the location of individual fecal samples

1.2 糞便 DNA 提取

使用QIAamp DNA糞便微型試劑盒從刮下的糞便表面提取總基因組DNA。 總共提取了279個(gè)DNA樣品。用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。袁巍[11]推薦的物種特異性引物用于物種鑒定。

Pta-CbF(5′-CTAATCTCATCAATCCTAATC-3′).

Pta-CbR(5′-TTGGTATGAGTACTAGAATA-3′).

在1.0%瓊脂糖凝膠中鑒定出222 bp的細(xì)胞色素b序列，并在瓊脂糖凝膠上和UV透射照明器上可視化。我們?cè)?0 μL體系中使用KOD FX Neo DNA聚合酶(TOYOBD)，并添加1 μL DNA，退火溫度為51 ℃。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物選擇

微衛(wèi)星是由2—5個(gè)核苷酸串聯(lián)的重復(fù)序列構(gòu)成，由于其多態(tài)性高，信息量大，實(shí)驗(yàn)步驟少且簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，DNA 需求量少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)分析。本研究選取了9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)并合成引物，進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。本研究所使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)均為2堿基重復(fù)，引物序列信息見表 1。

表1 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，遺傳多樣性參數(shù)和多態(tài)性信息含量(PIC)、平均等位基因(Na)、平均有效等位基因(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)Tab.1 9 microsatellite loci，genetic diversity parameters and polymorphism information content(PIC)，mean allele(Na)，mean effective allele(Ne)，observed heterozygosity(Ho)and expected heterozygosity (He)

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10 μL 10 × PCR Buffer，4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，各0.75 μL的上/下游引物 (10 mmol/L)，0.3 μL TOYOBO高保真酶，1.0 μL的模板DNA，使用ddH2O補(bǔ)足體系。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，55—58 ℃退火1 min，68 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。4 ℃保存。擴(kuò)增完畢后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有核酸染料的 1% 瓊脂糖凝膠中，以 120 V 的電壓電泳30 min，以確定PCR擴(kuò)增是否成功。每個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增3—5次，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用ABI3730X1 測(cè)序儀對(duì)所有微衛(wèi)星位點(diǎn)熒光標(biāo)記下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Micro-checker[12]來(lái)檢驗(yàn)無(wú)效等位基因和等位基因缺失。使用Excel Microsatellite Toolkit v 3.1.1[13]進(jìn)行個(gè)體鑒定。使用Cervus v.3.0.7[14]計(jì)算位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)。使用GenAlEx v.6.1[15]計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)和每個(gè)地理種群的等位基因數(shù)(Na)，有效等位基因數(shù)(Ne)，觀察(Ho)和期望(He)雜合度。另外，通過(guò)GenAlEx v.6.1測(cè)試了每個(gè)位點(diǎn)上每個(gè)種群的Hardy-Weinberg平衡(HWE)。使用GENEPOP v.4.0.11[16-17]測(cè)試位點(diǎn)的連鎖不平衡(LD)。利用 FSTAT v.2.9.3[18-19]軟件計(jì)算兩兩種群之間的FST。

BayesAss 1.3[20]允許居群偏離哈溫平衡，允許居群大小不同和遷移不對(duì)稱。應(yīng)用MCMC分析和Bayesian方法，通過(guò)確定居群近交系數(shù)和連鎖不平衡，計(jì)算當(dāng)代基因流，BayesAss 能估測(cè)個(gè)體遷移歷史的后驗(yàn)概率(posterior probability)，因此該方法可以用來(lái)估測(cè)5個(gè)地理種群間的擴(kuò)散情況和鄰接種群間的當(dāng)代基因流。使用多組種子數(shù)(seed number)和迭代次數(shù)，選擇對(duì)數(shù)似然值(log-likelihood values)最大時(shí)的不作數(shù)迭代次數(shù)(buin-in length)，將參數(shù)的變化值設(shè)為總迭代次數(shù)的40%—60%。本實(shí)驗(yàn)最終使用3×106的迭代次數(shù)，106的不作數(shù)迭代次數(shù)，設(shè)置取樣頻次(sample frequency)為2 000，以此獲得穩(wěn)定一致的后驗(yàn)概率。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

利用軟件 MicroChecker 2.2.3 對(duì)本研究使用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行等位基因檢測(cè)時(shí)，3 種估算方法(Oosterhout、Chakraborty 和 Brookfield法)均未探測(cè)到等位基因缺失或無(wú)效等位基因的存在。使用Microsatellite Toolkit進(jìn)行個(gè)體鑒定。結(jié)果表明，HC有21個(gè)個(gè)體，ZGCL有32個(gè)個(gè)體，WQ有82個(gè)個(gè)體，DN有37個(gè)個(gè)體，MT有43個(gè)個(gè)體。從279個(gè)糞便樣本中成功鑒定出215個(gè)個(gè)體(圖1)。

每個(gè)位點(diǎn)和每個(gè)種群共有45個(gè)哈迪-溫伯格平衡試驗(yàn)，21個(gè)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(表2)。在位點(diǎn)間僅檢測(cè)出少量位點(diǎn)在個(gè)別種群中可能存在連鎖現(xiàn)象，未見任何位點(diǎn)在3個(gè)以上種群中與其他位點(diǎn)連鎖，因此這9對(duì)微衛(wèi)星引物可以用于后續(xù)的分析研究。

表2 各種群 9 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的 Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)的 P 值及顯著性Tab.2 P value and significance of Hardy-Weinberg equilibrium chi-square test for 9 microsatellite loci in various groups

9個(gè)位點(diǎn)為中-高多態(tài)性，等位基因范圍為4.4—15.6個(gè)(表1)。5個(gè)群體中等位基因的平均數(shù)量為8.556—10.111。5個(gè)群體中等位基因的平均數(shù)量為8.556—10.111。由于WQ群體中個(gè)體數(shù)量最多，等位基因的數(shù)量會(huì)因個(gè)體數(shù)量的不同而有很大的差異。5個(gè)群體的觀測(cè)雜合度為0.693—0.730，期望雜合度為0.714—0.732(表3)。FST評(píng)估表明種群分化程度較低(FST范圍為-0.001 1—0.018 0，表4)?？傮w上，90%(9/10)的兩兩群體分化值與0差異顯著(P<0.05)。

表3 西伯利亞狍種群遺傳多樣性參數(shù)以及使用BayesAss1.3程序計(jì)算了5個(gè)地理種群在近1—3代之間的非移民比例(proportion non-migrants，95% CI)。糞便樣本數(shù)量(NS)、個(gè)體數(shù)量(N)、平均等位基因(Na)、平均有效等位基因(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)Tab.3 The parameters of genetic diversity of the Siberian roe deer population and the BayesAss 1.3 program were used to calculate the proportion of non-migrants(proportion non-migrants，95% CI)of the five geographical populations between the last and the third generation.Number of fecal samples(NS)，number of individuals(N)，mean allele(Na)，mean effective allele(Ne)，observed heterozygosity(Ho)and expected heterozygosity(He)

表4 種群間遺傳分化系數(shù)FSTTab.4 Population comparisons with FST values

2.2 基因流

使用 BayesAss 1.3計(jì)算的基于貝葉斯法的種群間定向基因流表明，5個(gè)地理種群間出現(xiàn)不對(duì)稱基因流(表5，圖2)，基因流從MT種群流向其他種群，其他種群間基因流動(dòng)對(duì)稱，同時(shí)MT種群有很高比例的“非移民”個(gè)體(97.15%)，表明MT是分散的源種群[21](表3)。其余各種群間也存在相當(dāng)程度的基因交流，如WQ到ZGCL(2.46%)，ZGCL到HC(1.01%)，WQ到HC(1.23%)，DN到HC(1.51%)等，說(shuō)明群體間存在較為廣泛的不對(duì)稱的基因流。

表5 種群間定向基因流評(píng)估Tab.5 Directional gene flow estimated

圖2 基于貝葉斯方法計(jì)算的5個(gè)地理種群間的近期定向基因流Fig.2 Recent directional gene flow between 5 geographic populations calculated based on Bayesian method

3 討論

在本研究中，調(diào)查了長(zhǎng)白山北部西伯利亞狍局域種群的遺傳多樣性和種群間基因流。我們檢測(cè)到高遺傳多樣性(He=0.714—0.732；表3)，雖低于德國(guó)北部歐洲狍微衛(wèi)星多樣性(He=0.74—0.79)[22]，但仍高于亞洲大部分西伯利亞狍種群(He=0.522—0.628)[9]。不同于盛清宇等[23]使用10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)長(zhǎng)白山北部區(qū)域西伯利亞狍局域種群遺傳特征的分析的研究，本研究中使用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，且對(duì)地理種群的劃分與其不同，雖各種群遺傳多樣性參數(shù)略有不同，但研究結(jié)果均表明長(zhǎng)白山北部區(qū)域西伯利亞狍局域種群遺傳多樣性高。估算群體間的遺傳分化系數(shù)可以區(qū)分群體間和群體內(nèi)相對(duì)遺傳變異大小，揭示群體遺傳變異的主要來(lái)源[24]。本研究中，長(zhǎng)白山北部區(qū)域狍種群不同地理群體間的遺傳分化水平很低(FST=-0.001 1—0.018 0，表4)，說(shuō)明遺傳變異絕大部分存在于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異所占比例極小。

群體遺傳學(xué)研究表明，引起群體產(chǎn)生遺傳分化的主要原因是遺傳漂變和自然選擇[25]。基因流能夠增加群體內(nèi)遺傳變異量，減少群體間的分化，使群體趨向于一致，其與遺傳漂變的作用是相互擷抗的[26]。在自然群體中，群體的分化差異程度與群體間的基因流大小緊密相關(guān)，即如果不同群體間的基因流強(qiáng)度越高，則該群體間的分化差異程度則相對(duì)越小[27-28]。本研究中各地理種群間存在廣泛的不對(duì)稱的基因流，抑制了遺傳漂變的作用，從而使得群體間的遺傳分化非常小。雖然還需要進(jìn)行更多的測(cè)試，但本研究表明長(zhǎng)白山北部狍局域種群似乎并沒有遺傳差異，基因持續(xù)交流是導(dǎo)致種群間遺傳分化低的主要原因。如果允許西伯利亞狍的連通性持續(xù)不變，我們可以預(yù)期在長(zhǎng)白山北部將會(huì)繼續(xù)擴(kuò)散，甚至不斷擴(kuò)大。然而，需要注意的是，本研究?jī)H探究了各種群間的基因流情況，但是何種原因?qū)е逻@種種群間的交流，需要進(jìn)一步分析研究。

4 結(jié)論

本研究表明長(zhǎng)白山北部狍局域種群具有較高的遺傳多樣性，遺傳信息豐富。其雜合度水平和等位基因豐富度高于亞洲其他地區(qū)的西伯利亞狍種群。5個(gè)局域種群之間，遺傳多樣性比較接近，未出現(xiàn)遺傳多樣性突高的情況。種群間存在不對(duì)稱基因流，且表明較大的基因流是長(zhǎng)白山北部狍不同地理種群間遺傳分化水平很低的主要原因。本研究表明，研究區(qū)域內(nèi)的西伯利亞狍種群具有良好的遺傳潛力，是可以進(jìn)行持續(xù)發(fā)展的種質(zhì)資源。因此，本研究為西伯利亞狍種群的科學(xué)管理提供了理論依據(jù)。

致謝：感謝國(guó)家自然科學(xué)基金(31872241)、中央高校基礎(chǔ)研究基金(2572017PZ14)和有蹄類食性分析中植物角質(zhì)細(xì)胞人工智能識(shí)別研究項(xiàng)目(201910225555)對(duì)本研究項(xiàng)目的資助。感謝寧瑤博士、溫都蘇博士、佘雯碩士、王姣碩士給予的幫助。野外采樣工作得到了項(xiàng)目區(qū)各林業(yè)局和保護(hù)區(qū)工作人員的支持和幫助，在這里一同表示感謝。