中國小麥短體線蟲種類的分子鑒定及地理分布

秦 鑫，王亞東，李紅梅，李 冉，王 暄

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210095)

短體線蟲(Pratylenchus)，又稱根腐線蟲(root-lesion nematodes)，是一類寄主眾多、分布廣泛的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，能夠侵染植物地下組織，引起組織腐爛壞死，并影響植物的生長和產(chǎn)量，同時短體線蟲造成的傷口為病原真菌和細(xì)菌的侵染提供便利[1]，引起復(fù)合病害的發(fā)生，進(jìn)一步加重經(jīng)濟(jì)損失，因此，短體線蟲也是全球10種最具破壞性的植物寄生線蟲之一[2]。近年來，在黃淮麥區(qū)孢囊線蟲(cereal cyst nematodes，CCN)發(fā)生分布的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，小麥根系及根際土壤中普遍存在短體線蟲和孢囊線蟲混合發(fā)生的現(xiàn)象[3-4]，劉海璐等[5]對采自中國江蘇、河南、山東和安徽4省麥區(qū)的10個短體線蟲樣品進(jìn)行分子鑒定，擴(kuò)增了核糖體rDNA(rDNA)18S、28S D2-D3和線粒體DNA(mtDNA)COI基因片段并測序，通過序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析明確了黃淮麥區(qū)短體線蟲種類有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲3個種，并證實了不同種群復(fù)合侵染小麥的現(xiàn)象較為普遍。短體線蟲和孢囊線蟲復(fù)合侵染的普遍發(fā)生將會進(jìn)一步加重中國小麥產(chǎn)量的損失，對中國糧食生產(chǎn)安全造成潛在的嚴(yán)重威脅。

短體線蟲屬種類比較多，迄今為止，已確定的有效種有104個[6-7]。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定需要足夠數(shù)量的成蟲用于形態(tài)學(xué)特征比較和測計，尤其當(dāng)樣品中存在短體線蟲混合種群時，需要先將不同的種區(qū)分后再依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，因此操作較為繁瑣且鑒定周期相對較長[5]。此外，短體線蟲屬種類間的形態(tài)鑒別特征較少，種群內(nèi)常存在形態(tài)特征的變異，容易導(dǎo)致種類鑒定出現(xiàn)偏差[8]。分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和PCR技術(shù)的普及，為短體線蟲種類的鑒定提供了有效的技術(shù)手段。Janssen等[6]通過分析核糖體rDNA的 28S、ITS和mtDNA-COI(mtCOI)基因序列，澄清了穿刺短體線蟲(P.penetrans)、偽短體線蟲(P.fallax)以及鈴蘭短體線蟲(P.convallariae)的分類爭議，并且通過比較這3個基因區(qū)域的序列，認(rèn)為mtDNA-COI基因是短體線蟲的一條可靠的條形碼標(biāo)記。劉海璐等[5]基于mtCOI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以有效地區(qū)分短體線蟲的近緣種，相比 rDNA 18S 和 28S 基因更適于短體線蟲種類的分子鑒定。因此，本研究利用mtCOI基因分子標(biāo)記對采自中國12個省(市、自治區(qū))的42個小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行鑒定，以探明中國小麥種植區(qū)短體線蟲的種類以及地理分布，為今后小麥短體線蟲的田間檢測以及制定小麥根部線蟲病害的防控策略提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

在2018年1-5月小麥生長期間，通過五點(diǎn)采樣法隨機(jī)采集中國江蘇、安徽、河南、山東、河北、湖北、天津、陜西、山西、新疆、甘肅和青海省(市、自治區(qū))的小麥苗和根圍土壤樣品；采用淺盤法分離各樣品中的線蟲，收集線蟲懸浮液，在體視顯微鏡下觀察懸浮液中的線蟲，隨機(jī)挑取短體線蟲制成臨時破片，在光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲的形態(tài)特征，共采集到42個小麥短體線蟲樣品，各樣品的采集地點(diǎn)和地理信息見表1。

1.2 單條線蟲DNA的提取

從42個樣品的線蟲分離液中，各隨機(jī)挑取 3～5條短體線蟲，用于DNA分子鑒定。單條線蟲DNA的提取參照宋志強(qiáng)等[9]的方法，將單條線蟲挑入滅菌ddH2O水滴中清洗1～2次后，挑取線蟲放入加有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)的200 μL PCR管中，液氮中冷凍2 min后，65 ℃處理4 min，重復(fù)3次；加入 1 μL 10 μg·μL-1蛋白酶K，65 ℃溫育1 h， 95 ℃處理10 min后，將得到的DNA粗提液置于 -20 ℃保存，備用。

1.3 短體線蟲mtCOI基因片段的擴(kuò)增

以上述各樣品的單條短體線蟲DNA樣本為模板，用通用引物JB3(5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′)和JB5(5′-AGCACCTAAACTTAAAACATAATGAAAATG-3′)[10]擴(kuò)增mtCOI基因片段，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板為1 μL，5 μmol·L-1的上、下游引物各2 μL，2×Ex Taq Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將所有擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物公司進(jìn)行純化和 測序。

1.4 短體線蟲mtCOI序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測序所得的短體線蟲mtCOI序列在NCBI中進(jìn)行比對并提交GenBank獲得序列號，下載有關(guān)短體線蟲種類的同源序列，進(jìn)行序列相似度分析。同時將所測的短體線蟲與已報道的不同短體線蟲的mtCOI序列利用軟件Geneious 7.1.4(Biomatters；http://www.geneious.com)[11]整理，去除同源性較低的位點(diǎn)。用在線軟件TranslatorX[12](http://translatorx.co.uk)選擇無脊椎動物線粒體遺傳密碼，采用氨基酸編碼序列比對mtCOI序列。用軟件jModelTest2[13]進(jìn)行核苷酸替換模型的評估，在赤池信息準(zhǔn)則(Akaike Information Criterion，AIC)下選擇模型GTR+I+G為構(gòu)建mtCOI系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的最佳模型。在CIPRES Science Gateway (www.phylo.org)運(yùn)算平臺上，用MrBayes 3.2.3[14]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹，在4條馬爾科夫鏈(Markov Chain)下獨(dú)立進(jìn)行3條熱鏈和1條冷鏈的1×106次運(yùn)行，每1 000代取樣一次且“burn-in”值設(shè)置為25%，采用多數(shù)一致(50%)原則，通過軟件FigTreev.1.4.3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的可視化處理。

1.5 小麥短體線蟲種類的鑒定和地理分布分析

根據(jù)mtCOI序列的比對、序列相似度和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果，對采集自12個省(市、自治區(qū))的42個小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行鑒定，并對短體線蟲種類發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥短體線蟲種類的形態(tài)鑒定結(jié)果

對采自12個省(市、自治區(qū))的42個小麥根圍和土樣樣品進(jìn)行線蟲分離后，分別從各樣品中隨機(jī)挑取約20條短體線蟲通過顯微鏡觀察其形態(tài)特征，同時查閱多岐檢索表及核對有關(guān)參考文獻(xiàn)[1]，發(fā)現(xiàn)這42個樣品主要含3種短體線蟲，分別為咖啡短體線蟲(P.coffeae)、落選短體線蟲(P.neglectus)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)，它們之間最主要的區(qū)別在于雌蟲的尾部和側(cè)帶區(qū)形態(tài)特征(圖1～圖3)。

咖啡短體線蟲的雌蟲唇區(qū)較低平，與體壁稍微縊縮，唇環(huán)2個；口針相對強(qiáng)壯，基部球圓形(圖1A)；中食道球卵圓形，食道腺長葉狀，腹面覆蓋腸(圖1B)；后陰子宮囊是陰門處體寬的1.0～ 1.5倍(圖1C)；尾圓錐形，末端寬圓，或平截，或缺刻，頂端無環(huán)紋(圖1D)；側(cè)帶區(qū)一般4～5條側(cè)線，偶爾6條(圖1E)。

A：體前端；B：食道；C：陰門；D：尾；E：側(cè)線(標(biāo)尺= 10 μm)。圖2和圖3同。

落選短體線蟲的雌蟲唇區(qū)前部輪廓呈角狀，唇環(huán)2個；頭架中度骨化，口針發(fā)達(dá)，中等長度，口針基部球較寬，前端平或凹陷(圖2A)；中食道球發(fā)達(dá)，食道腺覆蓋腸(圖2B)；后陰子宮囊約等于陰門處體寬(圖2C)；尾端錐形，末端圓，頂端光滑(圖2D)；側(cè)帶區(qū)一般4條側(cè)線(圖2E)。

圖2 落選短體線蟲雌蟲的光學(xué)顯微鏡照片

斯克里布納短體線蟲的雌蟲唇區(qū)較低略縊縮，唇環(huán)2個；頭骨化明顯，口針強(qiáng)壯，口針基部球圓，前端凹陷(圖3A)；中食道球卵圓形，食道腺覆蓋腸，覆蓋長度中等(圖3B)；后陰子宮囊中等長度，通常大于陰門處體寬(圖3C)；尾寬圓，或半圓，頂端平滑，沒有缺刻(圖3D)；側(cè)帶區(qū)一般4條側(cè)線(圖3E)。

圖3 斯克里布納短體線蟲雌蟲的光學(xué)顯微鏡照片

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在同一樣品中如果有短體線蟲混合種群發(fā)生時，單純依靠形態(tài)特征觀察、測計值比較和文獻(xiàn)核查進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定，很難將咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲準(zhǔn)確區(qū)分開，因此本研究對42個樣品的種類進(jìn)行了分子鑒定。

2.2 短體線蟲樣品的mtCOI基因片段擴(kuò)增結(jié)果

以42個短體線蟲樣品中隨機(jī)挑取的單條線蟲DNA為模板，分別用通用引物JB3/JB5擴(kuò)增mtCOI基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到1條約440 bp的條帶(部分結(jié)果見圖4)。將所有的擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技公司進(jìn)行測序，將獲得的測序結(jié)果進(jìn)行拼接后所有序列的長度為412～432 bp。

M:DNA marker DL2000; 1～24:來自不同樣品的單條線蟲。 1-24：Individual nematodes from different Pratylenchus samples.

2.3 短體線蟲種群的mtCOI序列分析

將測序獲得的短體線蟲mtCOI序列進(jìn)行BLAST比對，并與GenBank下載的來自不同國家不同短體線蟲種群mtCOI序列進(jìn)行比對和相似度分析。結(jié)果顯示，有9條短體線蟲的序列與咖啡短體線蟲日本群體(GenBank登錄號KU198942和KU198943)和中國群體(GenBank登錄號KY424072和KY424073)序列相似度最高，為98.8%～100%，這9條短體線蟲的序列差異值為0.000，序列相似度為100%；有30條短體線蟲的序列與落選短體線蟲玻利維亞群體(KU198940)、美國群體(KU198941)和中國群體(KX349423和KY424104)序列相似度最高，達(dá)96.5%～99.3%，這30條短體線蟲的序列差異值為0.000～0.037，相似度為96.3%～100%；有13條短體線蟲的序列與斯克里布納短體線蟲中國群體(KY424090)序列的相似度為95.0%～ 98.7%，這13條短體線蟲的序列差異值為 0.000～0.007，相似度為99.3%～100%。序列比對和相似度分析揭示，來自中國12個省(市、區(qū))的42個短體線蟲樣品中主要有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲3個種，并且樣品中存在單一種群侵染和復(fù)合種群侵染的現(xiàn)象。42個短體線蟲樣品的種群及其代碼見表1。

表1 小麥短體線蟲樣品的采集信息和種類鑒定

2.4 短體線蟲種群系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將測序所得的短體線蟲mtCOI序列(代碼見表1)與從NCBI下載的來自美國、英國、日本、南非和玻利維亞等國家的不同短體線蟲種群的mtCOI序列進(jìn)行比對后構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇北方根結(jié)線蟲(Meloidogynehapla)和山茶根結(jié)線蟲(M.camelliae)作為外群。從圖5可以看出，有30個短體線蟲種群(即：安徽種群AH8-2等，河南種群HN4-2等，山東種群SD2-1等，江蘇種群JS3-2等，天津種群TJ1-1等，山西種群SXY1-1，陜西種群SX1-4等，甘肅種群GS1-1等，青海種群QH1-1以及新疆種群XJ3-1等)與落選短體線蟲中國、美國、玻利維亞群體聚類在一個大分支，置信度達(dá)到100%。在這個大分支中有兩個明顯的亞分支，其中，有8個種群(GS1-1、GS2-1、QH1-1、SX3-2、TJ1-1、TJ2-1、XJ3-1和XJ7-1)與落選短體線蟲中國群體(KX349423和KY424104)、美國群體(KU198941)以及玻利維亞群體(KU198940)聚類在一個分支，置信度達(dá)到84%，其他22個種群則聚在另一個亞分支。

從圖5還可以看出，有9個短體線蟲種群(安徽種群AH6-1等，山東種群SD6-1，河北種群HEB1-1以及湖北種群HUB1-1)與咖啡短體線蟲日本群體(KU198942 和KU198943)和中國群體(KY424072和KY424073)聚類在一個分支，置信度達(dá)到100%。此外，HN4-1、SD4-2、SX2-1等13個種群均與斯克里布納短體線蟲中國群體(KY424090)聚類在同一個分支，置信度達(dá)到100%。

圖5 基于mtDNA-COI序列構(gòu)建的中國小麥短體線蟲種群Bayesian系統(tǒng)進(jìn)化樹

總之，通過貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，進(jìn)一步證實了采自中國12個省(市、自治區(qū))的42個短體線蟲樣品中有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲這3個種。

2.5 中國小麥短體線蟲的種類發(fā)生和地理分布

根據(jù)mtCOI序列的分子鑒定結(jié)果，對42個短體線蟲樣品的種類發(fā)生情況進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)落選短體線蟲單一侵染樣品有21個，占總樣品數(shù)的50%，是中國麥區(qū)的優(yōu)勢種群，咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品分別有6個和5個，分別占總樣品數(shù)的14.3%和 11.9%。短體線蟲的兩兩復(fù)合侵染樣品有10個，占總樣品數(shù)的23.8%，其中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有7個，而咖啡短體線蟲分別與落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有2個和1個。無論是單一種群侵染還是復(fù)合種群侵染，落選短體線蟲都呈現(xiàn)明顯的種群優(yōu)勢。

此外，在安徽省的7個樣品中，咖啡短體線蟲和落選短體線蟲單一侵染樣品分別有4個和1個，二者復(fù)合侵染的樣品有2個，咖啡短體線蟲為安徽省的優(yōu)勢種群；在河南省的5個樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染的樣品分別有2個和1個，二者復(fù)合侵染的樣品有2個；在山東省5個樣品中，咖啡短體線蟲和落選短體線蟲單一侵染的樣品分別有1個和2個，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染的樣品有2個；在陜西省的4個樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品各1個，二者復(fù)合侵染的樣品有2個；在江蘇省的2個樣品中，1個為落選短體線蟲單一侵染，1個為落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲復(fù)合侵染；在湖北省僅采集的1個樣品是咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲的復(fù)合侵染；在河北省采集的樣品中，咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品各有1個；在新疆采集的樣品中，落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲單一侵染樣品分別有7個和2個；而天津、山西、甘肅和青海4省的7個樣品均為落選短體線蟲單一侵染。

總之，落選短體線蟲在華東、華中和西北地區(qū)都有廣泛分布，是中國麥區(qū)的優(yōu)勢種群，咖啡短體線蟲主要分布在華東地區(qū)，而斯克里布納短體線蟲雖然不是優(yōu)勢種群，但是分布比較廣泛，在安徽、河南、山東、江蘇、河北、湖北、陜西和新疆等省都有零星發(fā)生。

3 討 論

國外已有大量關(guān)于短體線蟲危害麥類作物的報道，種類主要包括六裂短體線蟲(P.hexincisus)、盧斯短體線蟲(P.loosi)、落選短體線蟲(P.neglectus)、穿刺短體線蟲(P.penetrans)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)、桑尼短體線蟲(P.thornei)和玉米短體線蟲(P.zeae)等，其中對小麥危害較大的是落選短體線蟲、穿刺短體線蟲和桑尼短體線蟲[15]。中國安徽、四川、廣西、河南和西藏等地也有短體線蟲危害小麥的報道，已知種類包括落選短體線蟲、穿刺短體線蟲、咖啡短體線蟲、玉米短體線蟲、盧斯短體線蟲、敏捷短體線蟲(P.agilis)和草地短體線蟲(P.pratensis)等[5]。劉海璐等[5]對采自黃淮流域的江蘇、山東、河南和安徽4省的10個小麥短體線蟲樣品的種類進(jìn)行了分子鑒定。

本研究在劉海璐等[5]的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對采自華東、華北和西北地區(qū)的12個省(市、自治區(qū))的42個短體線蟲進(jìn)行了鑒定，更加明確了短體線蟲種類在中國的發(fā)生分布情況。李廣帥等[16]對從河南省9個地區(qū)采集的23個小麥短體線蟲進(jìn)行了分子鑒定，認(rèn)為有15個樣品為敏捷短體線蟲(P.agilis)，其他均為盧斯短體線蟲(P.loosi)，劉海璐等[5]對采自河南商丘的3個樣品進(jìn)行了鑒定，并未發(fā)現(xiàn)上述2種短體線蟲，本研究中采自河南的5個樣品中也未發(fā)現(xiàn)李廣帥等[16]發(fā)現(xiàn)的2種短體線蟲，據(jù)此本研究推測這些樣品的鑒定結(jié)果不同可能與采樣地點(diǎn)不同有關(guān)。綜合劉海璐等[5]和本研究的分析檢測，可以得知咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲這3種短體線蟲在江蘇、山東、河南和安徽4省的不同地區(qū)都有發(fā)生。

綜上所述，本研究采自12個省(市、自治區(qū))的小麥短體線蟲種類主要有咖啡短體線蟲、落選短體線蟲和斯克里布納短體線蟲，其中，落選短體線蟲是優(yōu)勢種群，在華東、華中和西北地區(qū)都有廣泛分布，咖啡短體線蟲主要分布在華東地區(qū)，而斯克里布納短體線蟲地理分布比較廣泛，在安徽、河南、山東、江蘇、河北、湖北、陜西和新疆等省都有零星分布。本研究基本明確了中國小麥主要種植省份的短體線蟲種類分布情況，為小麥短體線蟲病的防治提供了理論指導(dǎo)。