小麥西昌69的EMS誘變系蛋白品質(zhì)變異分析及種質(zhì)篩選

于利偉，陳愛(ài)艷，郭 雷，羊 陽(yáng)，李慧敏，謝彥周，劉樹(shù)偉，漆小泉，王中華，高 欣

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266237；3.中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京 100093)

小麥?zhǔn)侨蛑饕Z食作物之一，提供了人們?nèi)粘Ｋ璧闹饕参镄缘鞍踪|(zhì)[1]。隨著人們生活水平不斷提高，對(duì)小麥面制品的品質(zhì)要求越來(lái)越高，對(duì)優(yōu)質(zhì)小麥的需求呈不斷上升趨勢(shì)。由于小麥遺傳基礎(chǔ)狹窄，優(yōu)質(zhì)基因源匱乏，傳統(tǒng)的雜交育種途徑很難獲得突破性種質(zhì)。人工誘變能夠創(chuàng)造大量變異，通過(guò)人工誘變獲得有利用價(jià)值的變異材料已成為小麥新種質(zhì)選育的有效途徑。

引起種群基因頻率大幅度變化的關(guān)鍵原因是基因突變[2]?；蛲蛔兛煞譃樽园l(fā)突變和誘發(fā)突變，自發(fā)突變發(fā)生的頻率很低，而誘發(fā)突變指的是人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的變異，其發(fā)生率較高。在誘發(fā)突變中，化學(xué)誘變劑可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生可遺傳的變異體，其中甲基磺酸乙酯(EMS)是目前在作物誘變育種中效果較好、被廣泛應(yīng)用的化學(xué)誘變劑[3-5]。EMS誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變頻率高，多為G-C到A-T的轉(zhuǎn)換，染色體畸變相對(duì)較少，多數(shù)變異是易于篩查的顯性點(diǎn)突變[6-7]，因此被廣泛應(yīng)用于突變體的構(gòu)建。趙天祥等[8]利用EMS誘變小麥偃展4110種子，對(duì)M2代全生育期田間表型進(jìn)行觀察鑒定，獲得了株高在10～15 cm的特矮變異體。秘彩麗等[9]利用EMS處理小麥F1花藥，經(jīng)培養(yǎng)篩選得到耐鹽突變體。目前，許多研究利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建了突變體庫(kù)，并在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用[10]。但對(duì)小麥蛋白質(zhì)變異的研究相對(duì)較少，對(duì)突變體品質(zhì)的分析及優(yōu)質(zhì)材料的篩選尚缺乏快速準(zhǔn)確的方法。本研究以?xún)?yōu)良小麥品種西昌69的EMS誘變系M6代為試驗(yàn)材料，對(duì)其HMW-GS進(jìn)行分析，旨在為小麥突變體的品質(zhì)鑒定提供技術(shù)依據(jù)，為小麥品質(zhì)育種提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中國(guó)科學(xué)院植物研究所植物代謝與抗病研究組和山東大學(xué)植物細(xì)胞工程與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的小麥西昌69的EMS誘變系M5代種子。2017年10月份于楊陵西北農(nóng)林科技大學(xué)標(biāo)本區(qū)(108°4′E，34°160′N(xiāo))種植，每個(gè)誘變系種植一行，行長(zhǎng)1 m，行間距0.25 m，株距0.03 m，以西昌69為對(duì)照。兩次重復(fù)。成熟后收獲，得到1 667份M6代誘變系材料。

1.2 試驗(yàn)方法

通過(guò)分析M6代誘變系籽粒品質(zhì)性狀、高分子量麥谷蛋白亞基組成、不溶性蛋白聚合體含量等，快速篩選出優(yōu)于親本的誘變系材料。

1.2.1 籽粒品質(zhì)性狀測(cè)定

使用近紅外谷物分析儀分析小麥籽粒品質(zhì)參數(shù)，包括水分含量、粗蛋白含量、濕面筋含量、吸水率、淀粉含量、沉降值、容重、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、出粉率及最大阻力等。兩次重復(fù)。

1.2.2 千粒重測(cè)定

使用計(jì)數(shù)板數(shù)出200粒小麥籽粒，去除破碎、有病害或蟲(chóng)蛀過(guò)的籽粒，稱(chēng)重，乘5得到千粒重。三次重復(fù)。

1.2.3 高分子量谷蛋白亞基類(lèi)型鑒定

從收獲的1 667份M6代種子中各取1粒籽粒，利用SDS-PAGE鑒定其高分子量麥谷蛋白亞基組成，參照高 璇等[11]的方法并稍做修改。主要步驟如下：用50%的正丙醇去除樣品中的醇溶蛋白；用樣品提取液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.0%DTT] 65 ℃水浴提取30 min；用烷基化溶液[50%正丙醇，0.08 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.0)，1.4%的4-VP]烷化處理，65 ℃水浴30 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液于新的離心管中，加入上樣緩沖液[80 mmol·L-1的Tris-HCl(pH=8.0)，20%甘油，0.069 mol·L-1SDS， 0.02%溴酚藍(lán)染液]后上樣。采用SDS不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%，每孔上樣5.5 μL,每板初始電壓設(shè)置為100 V。染色液(10%冰醋酸，40%甲醇，0.05%考馬斯亮藍(lán)R250)染色約20 min，用脫色液(10%冰醋酸，40%甲醇)脫色約12 h，采用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.4 籽粒中不溶性蛋白聚合體含量(UPP) 測(cè)定

參照劉天紅[12]的方法提取M6代種子的UPP；利用安捷倫HPLC色譜儀和Biosep-SEC-S3000排阻色譜柱(孔徑300 ?，粒徑3.5 mm，300 mm，7.8 mm)分析樣品的蛋白質(zhì)含量。以含0.05%三氟乙酸的50%(v/v)乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行沖洗，流速0.5 mL·min-1，沖洗30 min。采用手動(dòng)積分獲取各個(gè)組分的比值，UPP值為SDS-不溶性聚合體蛋白的面積占SDS-可溶性聚合體蛋白和SDS-不溶性聚合體蛋白面積之和的百分比。兩次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 M6代EMS誘變系籽粒品質(zhì)性狀的變異

2.1.1 籽粒水分含量的變化

小麥籽粒內(nèi)部復(fù)雜的生理生化過(guò)程都與其水分狀態(tài)有關(guān)，淀粉和蛋白質(zhì)等生物大分子的水合狀態(tài)決定了淀粉合成途中關(guān)鍵酶的活性，從而影響淀粉的合成。由此可見(jiàn)，小麥籽粒的水分含量嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量及品質(zhì)的形成[13]。西昌69的水分含量為11.52%，其M6代誘變系的水分含量平均為12.14%，最大值為14.48%，最小值為10.56%(圖1A)。

2.1.2 籽粒粗蛋白含量的變化

小麥籽粒粗蛋白含量與面粉和面團(tuán)的多個(gè)質(zhì)量指標(biāo)存在正相關(guān)關(guān)系，與面包烘焙品質(zhì)存在顯著正相關(guān)關(guān)系，是影響面包質(zhì)量的決定因素[14-15]。西昌69的粗蛋白含量(干基)為16.37%，其M6代EMS誘變系的粗蛋白含量(干基)平均為 18.65%，最大值為24.55%，最小值為12.37%(圖1B)。

2.1.3 籽粒濕面筋含量的變化

西昌69的濕面筋含量為34.20%，其M6代EMS誘變系的濕面筋含量平均為39.40%，最大值為 52.50%，最小值為24.83%(圖1C)。

2.1.4 籽粒淀粉含量的變化

小麥籽粒中淀粉和蛋白質(zhì)含量共同決定了小麥的加工品質(zhì)[16]。小麥西昌69的淀粉含量為62.31%，其M6代EMS誘變系的淀粉含量平均為67.13%，最大值為79.97%，最小值為 52.34%(圖1D)。

2.1.5 面團(tuán)形成時(shí)間的變化

小麥面團(tuán)的形成時(shí)間與面包外觀存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]。西昌69的形成時(shí)間為4.20 min，其M6代EMS誘變系的面團(tuán)形成時(shí)間平均為 4.67 min，最大值為6.50 min，最小值為0.95 min(圖1E)。

2.1.6 面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間的變化

小麥面團(tuán)的穩(wěn)定時(shí)間與面包膨脹度、面包體積存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但與面包外觀存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]。小麥西昌69的穩(wěn)定時(shí)間為13.40 min，其M6代EMS誘變系的面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間平均為16.40 min，最大值為32.55 min，最小值為 2.75 min(圖1F)。

2.1.7 籽粒沉降值的變化

小麥沉降值是衡量小麥面筋數(shù)量和質(zhì)量的間接綜合指標(biāo)，沉降值越大，表明面筋強(qiáng)度越大[17]。小麥西昌69的沉降值為40.22 mL，其M6代EMS誘變系的沉降值平均為47.09 mL，最大值為71.58 mL，最小值為25.21 mL(圖1G)。

2.1.8 籽粒容重的變化

小麥容重對(duì)面粉的品質(zhì)性狀有一定影響[17]。小麥西昌69的容重為789.5 g·L-1，其M6代EMS誘變系的籽粒容重平均為775.1 g·L-1，最大值為834.5 g·L-1，最小值為726.5 g·L-1(圖1H)。

A：水分含量；B：粗蛋白含量；C：濕面筋含量；D：淀粉含量；E：形成時(shí)間；F：穩(wěn)定時(shí)間；G：沉降值；H：容重。

2.2 M6代千粒重的變化

小麥籽粒產(chǎn)量與其蛋白質(zhì)含量一般呈負(fù)相關(guān)[18]，千粒重是影響產(chǎn)量的重要因素。小麥西昌69的千粒重為50.76 g，其M6代EMS誘變系的千粒重平均為46.02 g，最大值為60.83 g，最小值為26.23 g(圖2)。

圖2 西昌69 EMS誘變系M6代籽粒的千粒重

2.3 M6代籽粒中高分子量谷蛋白亞基的變異

SDS-PAGE結(jié)果(圖3)表明，西昌69的高分子量麥谷蛋白亞基組成為1、17+18和2+12，對(duì) 1 667份M6代籽粒進(jìn)行高分子量麥谷蛋白亞基鑒定和分析，與西昌69對(duì)比，發(fā)現(xiàn)101份高分子量麥谷蛋白亞基變異型材料，變異率為6.06%。在101份HMW-GS變異材料中，共鑒定出19種不同的HMW-GS組合類(lèi)型，其中亞基缺失型3種，共16份變異材料；亞基置換型型8種，共34份變異材料；亞基缺失且發(fā)生置換8種，共27份變異材料；有24份變異材料出現(xiàn)了新型亞基，有待進(jìn)一步研究。

圖3 西昌69 EMS誘變系M6代籽粒HMW-GS的SDS-PAGE圖譜

由表2可知，在Glu-A1位點(diǎn)上的變異主要表現(xiàn)為1亞基的缺失及1亞基變?yōu)?*亞基，其中1亞基缺失(null)出現(xiàn)頻率最高，達(dá)30.69%。這與前人研究結(jié)果相似，即在Glu-A1位點(diǎn)上，null為優(yōu)勢(shì)亞基變異類(lèi)型[19-22]。

表2 西昌69EMS誘變系的M6代籽粒HMW-GS變異分析

在Glu-B1位點(diǎn)上，HMW-GS的變異類(lèi)型較為豐富，檢測(cè)到7+8、7+9、14+15共3種類(lèi)型，以7+8亞基出現(xiàn)頻率最高(20.79%)，7+9亞基次之(14.85%)。這3種亞基組合與親本的17+18亞基相比，并不優(yōu)質(zhì)[23]。造成這種現(xiàn)象的主要原因是EMS誘變是無(wú)方向性的，在部分材料品質(zhì)提高的同時(shí)，可能會(huì)使部分材料的品質(zhì)降低。

在Glu-D1位點(diǎn)上的變異，主要表現(xiàn)為2亞基或12亞基的缺失以及2+12亞基變?yōu)?+10亞基，其中5+10亞基變異頻率最高(26.73%)。表明5+10亞基為西昌69的EMS誘變系在Glu-D1位點(diǎn)的主要變異形式。

2.3 M6代籽粒UPP值的變化

面粉的UPP含量與蛋白質(zhì)、沉淀值等主要品質(zhì)參數(shù)顯著正相關(guān)，面粉的UPP值越大，小麥的綜合質(zhì)量越好[24]。在101份HMW-GS變異材料中，根據(jù)籽粒重要品質(zhì)性狀，如水分含量、粗蛋白含量、濕面筋含量、沉降值、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間等，篩選出35份優(yōu)于親本品質(zhì)性狀的變異材料，利用高效液相色譜技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行UPP值分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西昌69的UPP值為31.16%，35份誘變系材料的UPP值平均為35.88%，最小值為27.47%，最大值為45.84%，變異率為58.95%。其中，有7份材料(M1020、M1313、M1455、M1648、M1652、M1730、M1778)的UPP值略低于親本，其余28份材料的UPP值均大于親本(表3)。

比較35份篩選出的M6代籽粒的UPP值及千粒重(表3)，發(fā)現(xiàn)其UPP和千粒重均超過(guò)親本的誘變系有：M636、M783、M1346、M1503，其余多個(gè)材料的千粒重與親本相差無(wú)幾；且大部分誘變系的UPP值大于親本。有28份具有優(yōu)于親本籽粒品質(zhì)性狀且千粒重相對(duì)穩(wěn)定的誘變系材料。

表3 35份優(yōu)質(zhì)西昌69 M6代EMS誘變系的千粒重及UPP

表1 EMS誘變西昌69的M6代籽粒HMW-GS組成類(lèi)型

3 討 論

目前,許多研究利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建了突變體庫(kù)，并在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用[10]，但針對(duì)與小麥品質(zhì)相關(guān)的貯藏蛋白變異的研究相對(duì)較少。本研究結(jié)果表明，西昌69的EMS誘變系M6代籽粒品質(zhì)性狀與親本相比差異較大，其中，穩(wěn)定時(shí)間的變異率最大。原因可能是穩(wěn)定時(shí)間由多個(gè)位點(diǎn)控制[25]，誘變系的HMW-GS有豐富的變異類(lèi)型。前人研究顯示，EMS誘變易導(dǎo)致控制編碼HMW-GS的基因發(fā)生沉默[26]，如徐艷花等[27]利用EMS誘變?cè)マr(nóng)201種子，發(fā)現(xiàn)其M2代突變體有21個(gè)缺失不同亞基的突變體，突變頻率為2.26%。本研究中，在Glu-A1位點(diǎn)和Glu-D1位點(diǎn)均發(fā)生亞基的缺失，突變頻率為2.28%，突變頻率均較高。原因可能是EMS誘變導(dǎo)致DNA片段上出現(xiàn)單堿基的變化或缺失，進(jìn)而表現(xiàn)為蛋白的缺失。一般來(lái)說(shuō)，EMS誘變產(chǎn)生的HMW-GS不良變異較多，而優(yōu)良變異較少[8]。本試驗(yàn)也獲得了一些優(yōu)質(zhì)亞基組合，如1、17+18、5+10，null、17+18、5+10，null、17+18、2+12為變異材料中優(yōu)質(zhì)亞基類(lèi)型，含有這些亞基的多個(gè)籽粒品質(zhì)性狀有所提高。這與前人關(guān)于17+18、5+10為優(yōu)質(zhì)亞基的結(jié)論相符[23,28]。另外，劣質(zhì)亞基組合主要在Glu-B1位點(diǎn)產(chǎn)生，原因可能是EMS誘變?cè)诰幋aGlu-B1的基因中產(chǎn)生比其他基因更多的過(guò)早終止密碼子，從而使蛋白組成發(fā)生改變[29]。在本研究中，還有部分誘變系出現(xiàn)了新型亞基，在閆 炯等[26]的研究中也出現(xiàn)了相似的結(jié)果，在Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)呈現(xiàn)出缺失和新增亞基2種情況。原因可能是經(jīng)過(guò)EMS誘變處理以后，引起了基因的沉默和新基因的表達(dá)或引起麥谷蛋白結(jié)構(gòu)基因的變異，從而導(dǎo)致小麥在蛋白水平上發(fā)生了變異[30]。本研究?jī)H獲得初步結(jié)果，關(guān)于新型高分子量谷蛋白亞基所產(chǎn)生的原因及其對(duì)小麥品質(zhì)的影響還需進(jìn)一步更深入研究。

小麥的粗蛋白含量、濕面筋含量、穩(wěn)定時(shí)間及形成時(shí)間等籽粒品質(zhì)性狀與強(qiáng)筋小麥品質(zhì)顯著正相關(guān)[31]，UPP與小麥綜合質(zhì)量呈正相關(guān)關(guān)系[24]。本研究篩選出的28份較親本UPP提高的誘變系，其各品質(zhì)性狀也優(yōu)于親本。在今后誘變材料的篩選中，UPP可以作為微量快速、鑒定及篩選優(yōu)質(zhì)誘變材料的指標(biāo)。對(duì)于篩選出的28份品質(zhì)提高的誘變系，我們將會(huì)在不同環(huán)境條件下種植，以檢驗(yàn)其品質(zhì)穩(wěn)定性。