小米椒恒溫發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分動態(tài)變化研究

蔡雪梅，易宇文，喬明鋒，何 蓮，鄧 靜，彭毅秦

（四川旅游學院 烹飪科學四川省高等學校重點實驗室，四川 成都 610100）

辣椒由于其鮮艷的顏色、復雜的辛辣味和香氣以及抗氧化、鎮(zhèn)痛等功效，在全世界都被廣泛食用。不同品種的辣椒物理性質、風味特點、抗氧化能力等都存在一定差異[1]。小米椒是辣椒的一種，個體較小，紅帶橙色。小米椒發(fā)酵制品是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵調味品之一，其風味獨特，酸辣可口，能促進食欲，同時還有防腐抗氧化等功能[2-4]。

辛辣味是辣椒制品最主要的屬性之一，但是揮發(fā)性化合物與辣椒風味息息相關，風味是辣椒及其制品品質的重要內容，且消費者接受食物的主要選擇標準之一就是風味，因此對辣椒及其制品的揮發(fā)性化合物的研究至關重要，探索辣椒發(fā)酵過程中主要香氣貢獻物的形成與變化可為生產工藝的調控提供有價值的信息[5]。成熟的小米椒主要揮發(fā)性化合物是酯類和萜烯類化合物，主要包括4-methylpentyl 5-methylpentanoate、4-甲基戊基2-甲基丁酸酯、3-甲基丁酸甲酯、（R）-檸檬烯、萜品烯等，賦予小米椒柑橘香、甜香和果香[6]。巴西辣椒也是以果香為主，但不同品種的巴西辣椒主要揮發(fā)性化合物存在差異，Malagueta辣椒以酯類為主，Murupi辣椒倍半萜類物質為主，Dedo-de-mo?a辣椒則以醛類和甲氧基吡嗪類為主[7]。辣椒經過不同的處理風味也會存在差異，煙熏的辣椒具有較為強烈的煙熏香氣味，品質較高，與之相關的物質主要是酯類和醇類，烘干的辣椒保留水果香，以醛類為主，曬干的辣椒有稻草香，品質較低[8]。除辣椒干制外，辣椒發(fā)酵也是常見的辣椒加工方式，其能保持鮮椒口感，又耐貯藏。不同品種辣椒發(fā)酵后風味物質差異較大，黃平線椒以酯類物質；施秉線椒和大方皺椒以醇類物質相對含量最高；百宜平面椒和花溪黨武辣椒以烴類為主[9]。在發(fā)酵過程中辣椒的風味也會發(fā)生變化，朝天椒剁辣椒在自然發(fā)酵前后最主要的風味成分都是烯烴類化合物，但是發(fā)酵過程中酯類和酸類物質相對含量都顯著增加[10-11]。

目前辣椒的發(fā)酵多采用自然發(fā)酵，風味受影響因素較多，難以推測其變化機理。因此本課題將小米椒進行恒溫發(fā)酵，采用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯(lián)用技術（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）對小米椒發(fā)酵過程中不同時期香氣物質組成進行分析，研究發(fā)酵小米椒在制作過程中香氣物質組成的變化，以及香氣成分的動態(tài)變化規(guī)律，以期為小米椒的發(fā)酵工藝優(yōu)化、品質保證以及發(fā)酵過程中風味調控提供理論科學依據，同時，該研究對在工業(yè)生產中恒溫條件下控制發(fā)酵時間獲得發(fā)酵小米椒的最佳風味具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米椒、大蒜、蔗糖、食用鹽、純凈水、白醋、味精：市售。

實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BT423S型電子天平：德國賽多利斯公司；SQ8/Clarus 680氣相色譜質譜聯(lián)用儀：美國Per-kinElmer公司；57318 CAR/PDMS（75 μm）萃取頭、Supelco手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司；15 mL頂空瓶：北京譜朋科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照易宇文等[3]的發(fā)酵方法，選取清洗干凈無破損的小米椒置于發(fā)酵壇中，加入2%蔗糖、10%食鹽、6%醋、0.2%味精、0.5%大蒜以及純凈水，攪拌均勻，密封，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵16 d，每隔2 d取樣。所取樣品裝于取樣袋中，置于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 感官評價

挑選有品評經驗的14名食品專業(yè)學生（7男7女）組成品評小組，參照參考文獻[2]的方法，從色澤、體態(tài)、香味、質感和滋味五個方面進行感官評分。品評員評分時，在口中充分咀嚼后咽入，每個樣品重復評價3次，每次品嘗前后用溫水漱口。

1.3.3 氣相色譜質譜分析

參照KANG K M等[12]的方法，并略作改動。頂空條件：稱取4 g搗碎的小米椒于15 mL頂空瓶中，平衡溫度70 ℃，時間30 min，然后將老化（250 ℃，10 min）的萃取頭（75 μm CAR/PDMS）插入頂空瓶中吸附30 min，再將萃取針頭插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃條件下解吸4 min。

氣相條件：進樣口溫度250 ℃；色譜柱Elite-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至200 ℃，保持3min。載氣：氦氣（He）（純度99.999 9%），流速1 mL/min，分流比10∶1。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲1 min；全掃描；質量掃描范圍：33～500 m/z；標準調諧文件。

定性與定量分析：將質譜圖與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）2011版標準質譜庫對照，正反匹配度均＞700，并比對相關文獻進行確定，定量分析采用峰面積歸一化法。

1.3.4 數據處理

用軟件Excel、SPSS 20.0、Origin 8.5和HemI進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 感官評價分析

小米椒發(fā)酵過程中感官變化見圖1。

圖1 小米椒發(fā)酵過程中感官評分雷達圖Fig.1 Radar plot of sensory score of shimatogarashi during the fermentation

由圖1可知，在發(fā)酵過程中，小米椒的色澤評分先降后增，新鮮小米椒顏色鮮艷，發(fā)酵中色素可能分解，而在微生物的作用下又會產生新的變化；而隨著發(fā)酵時間的延長，小米椒的體態(tài)和質感變化不顯著，在發(fā)酵起始，小米椒的形態(tài)最完整，脆度最好；小米椒香味和滋味都在14 d達到最高，發(fā)酵香氣濃郁，酸辣味純正柔和，口感協(xié)調，在16 d有所下降，因此設置發(fā)酵時間為16 d，來研究此段發(fā)酵時間里小米椒的風味物質的變化。

2.2 小米椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分種類的變化

9個不同發(fā)酵時間的小米椒經GC-MS檢測共鑒定出144種揮發(fā)性成分，包括29種酯、48種烴、25種醇、8種酮、17種醛、4種酚、3種呋喃、4種含氮類、9種含硫類和1種酸，每類物質的相對含量和數量見表1。發(fā)酵辣椒的揮發(fā)性風味物質的數量主要取決于辣椒品種以及發(fā)酵工藝。歐陽晶等[11]以壇壇香4號紅線椒為原料進行高鹽發(fā)酵，在高鹽發(fā)酵辣椒中共檢測到66種化合物，其中酯類最多，有18種；路寬等[9]的研究表明，不同品種辣椒發(fā)酵后揮發(fā)性成分差異較大。小米椒在發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分種類和數量都在發(fā)生變化。在發(fā)酵初期，小米椒含有66種物質，相對總含量78.23%，其中最主要的是烴類化合物，成熟的小米椒中萜烯類化合物占主要部分[6]；其次是酯類物質和醇類物質；發(fā)酵初期沒有呋喃類和含氮類物質，但含硫類化合物種類較多。隨著發(fā)酵的進行，總的揮發(fā)性成分種類整體上先增加后減少，在14 d時種類最多為71種，且相對含量最高為97.12%。酯類和烴類在發(fā)酵中也是先增后減的趨勢，酯類主要是微生物代謝產生的酶催化生成，在發(fā)酵6～12 d相對含量較高。烴類化合物在發(fā)酵第14天相對含量最高，達到60.95%。醇類在發(fā)酵過程中逐漸減少，而醛類與之相反，逐漸增加，酮類和酚類沒有明顯變化。酸類僅在發(fā)酵14 d的樣品中檢測到，有且僅有一種酸。含氮類化合物種類較少，且在一些樣品中未檢測到，在第14天的樣品中相對含量相對較高，為2.49%。含硫類化合物相對含量較高，在發(fā)酵第2天和第4天相對含量較低，分別為6.87%、5.62%，最高達到19.82%。

表1 不同發(fā)酵時間的小米椒揮發(fā)性成分種類及相對含量Table 1 Types and relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time

2.3 小米椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香味物質的變化

小米椒中各揮發(fā)性成分的相對含量見表2，對小米椒中相對含量大于1%的組分進行熱圖分析，結果見圖2。

從表2和圖2可以看出，在小米椒發(fā)酵的16 d內，最主要的揮發(fā)性成分都是烴類物質，相對含量最高的是香樹烯，分別是7.18%、13.63%、15.17%、14.82%、12.28%、11.82%、8.50%、11.98%、17.56%，其次是二甲基十三烷、2-甲基-1-十四（碳）烯、2-甲基四癸烷。烷烴類物質香氣較弱，一般不作為發(fā)酵辣椒的呈香物質[9]，而烯烴類物質一般閾值較低，且相對含量較高、種類豐富，是發(fā)酵辣椒中的主要呈香物質，呈現(xiàn)豐富的木材、水果和香料的復合香[7]。在辣椒粉中，烯烴類物質對其風味也有較大貢獻。

酯類物質是發(fā)酵小米椒中的第二大揮發(fā)性成分，其中2-甲基丁酸己酯相對含量較高，從發(fā)酵起始到終止其相對含量分別是4.82%、2.26%、1.11%、3.24%、3.52%、2.72%、6.26%、2.34%、2.81%。另外，相對含量＞1%的酯類還有柳酸甲酯、己酸己酯、反式-4-癸烯酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸芳樟酯。辣椒在成熟過程中，酯類物質含量逐漸下降，在發(fā)酵過程中，酯類物質主要是由有機酸和醇類物質在酶的作用下酯化形成，提供強烈的果香，且閾值較低[13]，是辣椒制品的重要呈香物質。

除烴類和酯類外，醇類是發(fā)酵小米椒的第三大類物質，最主要的是乙醇和芳樟醇。乙醇在發(fā)酵過程中由于酵母菌的酒精發(fā)酵作用，相對含量逐漸增加，分別是0.24%、1.08%、1.64%、2.35%、2.13%、3.02%、3.96%、5.21%、5.34%，在發(fā)酵12 d到14 d，乙醇含量增幅顯著（P＜0.05），使小米椒具有特殊的酒香氣。與乙醇變化趨勢相反的有正己醇、正庚醇、蘑菇醇、反式-橙花叔醇、α-松油醇以及芳樟醇，其中以芳樟醇相對含量較高，在發(fā)酵過程中分別是4.40%、3.98%、2.19%、1.29%、2.26%、1.88%、2.17%、1.68%、0.21%，在辣椒汁的發(fā)酵過程中，芳樟醇的含量也是逐漸降低，賦予小米椒青香[14]。另外，正己醇具有果香和甜椒香，庚醇具有蘑菇香和脂肪香，苯甲醇具有花香和果香[15]，整體豐富了發(fā)酵小米椒的香氣。

表2 不同發(fā)酵時間的小米椒揮發(fā)性成分相對含量Table 2 Relative contents of volatile components of shimatogarashi in different fermentation time

續(xù)表

續(xù)表

圖2 小米椒揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of volatile components of shimatogarashi

醛類和酮類物質雖然在小米椒中相對含量較低，但兩種物質閾值也較低[16]，對小米椒發(fā)酵后的整體風味具有重要作用。醛類物質在發(fā)酵過程中種類和相對含量都在逐漸增加，在發(fā)酵初期，只有（E）-2-庚烯醛和巴豆醛，兩者相對含量分別是0.79%和0.12%；在發(fā)酵14 d時，醛類物質種類最多且總的相對含量最高，分別有2-己烯醛（0.15%）、（E）-2-庚烯醛（1.38%）、巴豆醛（0.35%）、反式-2-壬烯醛（0.33%）、反，反-2,4-庚二烯醛（0.28%）、正己醛（0.26%）、苯甲醛（0.26%）、反式-2-戊烯醛（0.26%）、十五醛（0.22%）、苯乙醛（0.12%）。醛類一般呈現(xiàn)青草香和脂肪香，氣味較好，但過量的醛會引起食品的酸敗和苦澀味[17]。在本研究中，發(fā)酵16 d時，醛類物質有下降趨勢。酮類物質相對含量在發(fā)酵過程中變化較小，但種類變化較大，僅有BETA-二氫紫羅蘭酮在發(fā)酵各個階段均存在。酸類物質僅有乙酸在發(fā)酵14 d的樣品中檢測到，可能是因為在這個發(fā)酵體系中植物乳桿菌和酵母菌的產酸能力較弱。有研究表明，在發(fā)酵的辣椒汁中檢測到13種酸類，包括乙酸、辛酸、壬酸等；在發(fā)酵鲊辣椒中檢測到5種酸，但其中不含乙酸，說明不同品種辣椒發(fā)酵產酸情況不一樣[14，18]。

呋喃類物質在小米椒發(fā)酵前期未能檢測到，在發(fā)酵第14天檢測到2-正戊基呋（0.79%）和2,3-二氫苯并呋喃（0.12%），閾值較低，具有黃油和八角的味道。含氮類物質在也是在發(fā)酵14 d時含量相對含量最高，含有氨基甲酸銨（2.21%）和N-甲基吡咯（0.28%）兩種。除上述物質之外，還有特殊香味的含硫類化合物，在大蒜和洋蔥中含硫類物質含量較高[9]。在發(fā)酵過程中含硫類物質最高相對含量達到19.82%，形成了發(fā)酵小米椒獨特的風味，在發(fā)酵10 d后相對含量逐漸下降，其中以二烯丙基二硫為主，其相對含量分別是12.64%、5.23%、4.99%、12.87%、7.72%、16.76%、13.92%、10.67%、6.53%。二烯丙基二硫具有生物活性作用，能夠誘導人胃癌細胞分化、抑制其侵襲[19]。在發(fā)酵后期，小米椒中還含有烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚等。

2.4 小米椒發(fā)酵過程中的風味差異分析

在圖2中，熱圖橫軸是通過聚類分析得到的發(fā)酵過程中小米椒樣品的聚類情況[20]，可以看出剛開始發(fā)酵的小米椒的風味與后面發(fā)酵過的差異較大，發(fā)酵2 d和4 d的較為相似，10 d和12 d的較為相似，較為奇怪的是發(fā)酵8 d與14 d以及16 d的風味差異不大。

為了驗證熱圖聚類結果，根據小米椒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性化合物，對小米椒進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果見圖3。PCA通過降維分析能夠考察多個變量間的相關性以及差異性，分析結果中第1主成分（PC1）的方差貢獻率為54.690%，第2主成分（PC2）的方差貢獻率為40.888%，總和＞95%，能夠很好地反映各樣品信息并體現(xiàn)出樣品之間的差異。從距離來看，同熱圖聚類一樣，起始階段的小米椒與其他樣品距離較遠，差異較大；第2天和第4天、第12天和第10天、第6天和第8天、第14天和第16天分別距離較近，風味化合物的組成及含量較為相似，說明小米椒在28 ℃恒溫發(fā)酵過程中，大約是以4 d為一個時間段風味發(fā)生較大變化。

圖3 小米椒揮發(fā)性物質主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile components of shimatogarashi

3 結論

本實驗以新鮮小米椒為原料，在28 ℃恒溫條件下進行發(fā)酵，利用HS-SPME-GC-MS技術對不同發(fā)酵時間的發(fā)酵小米椒進行分析，研究恒溫發(fā)酵小米椒的主要揮發(fā)性成分變化規(guī)律。結果表明，小米椒中揮發(fā)性成分包括酯、烴、醇、酮、醛、酚、酸、呋喃、含硫類以及含氮類化合物，其中以烴類為主，尤其是香樹烯、二甲基十三烷和2-甲基-1-十四（碳）烯。從發(fā)酵開始到結束，每隔2 d的小米椒中分別檢測到66、62、64、53、64、61、66、70、66種化合物，各類物質在種類上都有不同程度的變化，但整體上趨于平均。在相對含量上，烴類、酯、醇、醛、酚以及呋喃的相對含量在發(fā)酵過程中都明顯增加，含硫類相對下降。在發(fā)酵14 d時，小米椒中風味物質的種類及相對含量均相對較。綜合電子鼻PCA分析、GC-MS聚類分析以及感官分析，不同發(fā)酵時間的小米椒風味物質存在差異，發(fā)酵14d的小米椒香味濃郁、口感協(xié)調，風味最佳。