濃香型白酒窖泥微生物群落研究進(jìn)展

高占爭，吳正云，張文學(xué)

（1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川水井坊股份有限公司，四川 成都 610037）

多菌自然發(fā)酵是中國白酒的一大特色[1]。濃香型白酒除了糟醅、大曲的多菌種自然發(fā)酵外，還包括泥窖的窖泥中多種微生物的作用。而且泥窖是濃香型曲酒釀制之本，老窖是產(chǎn)好酒的最根本條件[2]。泥窖的窖泥中存在多種微生物，經(jīng)過長時(shí)間持續(xù)不斷地生產(chǎn)活動(dòng)，形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[3]，這些微生物以窖泥為基地，不僅自身代謝產(chǎn)生的一些物質(zhì)會(huì)進(jìn)入糟醅中，而且會(huì)通過黃水進(jìn)入糟醅中進(jìn)行代謝活動(dòng)[4]，其中的一些代謝物質(zhì)（如己酸、己酸乙酯等）會(huì)通過糟醅蒸餾進(jìn)入酒中，成為濃香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)而影響濃香型白酒的質(zhì)量和風(fēng)格[5]。因此研究窖泥微生物，可以進(jìn)一步弄清楚白酒多菌種自然發(fā)酵原理，對(duì)提高濃香型白酒質(zhì)量具有重要意義。

1 基于傳統(tǒng)微生物技術(shù)對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)

對(duì)窖泥中微生物的重要性的認(rèn)識(shí)始于20世紀(jì)60年代，1964年在茅臺(tái)窖池底部的窖泥中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)丁酸和己酸的梭狀芽孢桿菌，最終證明了己酸乙酯的確是窖底香味成分，并對(duì)濃香型白酒發(fā)展起到了促進(jìn)作用[6]。由此拉開了窖泥微生物研究的序幕。隨后吳衍庸等[7-11]對(duì)濃香型白酒窖泥微生物進(jìn)行了深入研究，包括不同窖齡酒窖窖泥細(xì)菌數(shù)量分布，各類厭氧細(xì)菌在不同窖泥中的數(shù)量分布，釀酒功能菌的分離鑒定以及利用功能菌制作人工窖泥等。其中對(duì)己酸梭菌、甲烷菌等作了重點(diǎn)研究，也取得了很多非常有意義的成果。就己酸菌來說，內(nèi)蒙古輕工科學(xué)研究所首先從濃香型白酒窖池窖泥中分離得到梭菌[12]。一些有代表性的菌株有：吳衍庸等[13-14]從五糧液與瀘州老窖窖泥中分離的產(chǎn)己酸梭菌被命名為盧型梭菌（后經(jīng)鑒定為巴氏梭菌（Clostridium barkeri）；徐占成等[15]從劍南春集團(tuán)窖泥中分離到耳渦形梭菌（Clostridium cochleatum）；黑龍江省輕工所的黑輕80#己酸菌[16]，遼寧大學(xué)的L-Ⅱ等[17]，這幾種菌雖然都產(chǎn)己酸但生理生化性質(zhì)不同。從五糧液和瀘州老窖窖泥分離的梭菌，兼性厭氧，利用乙醇和乙酸鹽合成己酸，產(chǎn)生少量乙酸、丁酸，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生少量丁酸[13-14]?？耸纤缶焕闷咸烟?，利用乙醇和乙酸生成丁酸和己酸，嚴(yán)格厭氧。耳渦形梭菌嚴(yán)格厭氧，在改良的巴氏培養(yǎng)基或厭氧培養(yǎng)基中，發(fā)酵生成正丁醇、丁酸與己酸[15]。甲烷菌也是窖泥中重要的功能微生物，目前的研究已證明，老窖窖泥的甲烷菌數(shù)量明顯多于新窖，可作為老窖一種指針菌。甲烷菌更重要的作用是與己酸菌和其他氫型發(fā)酵菌的相互耦聯(lián)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)“種間氫轉(zhuǎn)移”，實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)實(shí)踐都已證明甲烷菌與己酸共同發(fā)酵可以促進(jìn)己酸的生成[18]。

2 基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)

在窖泥微生物研究中，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，目前應(yīng)用較多的是變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)，此外還有技術(shù)核糖體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（amplifed ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）等，構(gòu)建16S rDNA/rRNA克隆文庫，再深度測(cè)序技術(shù)。這些技術(shù)的應(yīng)用使得對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)從單一微生物到微生物群落的轉(zhuǎn)變。通過DGGE等技術(shù)認(rèn)識(shí)到窖泥中除了有細(xì)菌外，還有古菌和真菌，見表1。

表1 基于PCR-DGGE等技術(shù)的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)Table 1 Microbial community structure in pit mud based on PCR-DGGE and other techniques

由表1可知，不論是新窖泥還是老窖泥，厚壁菌門微生物始終是優(yōu)勢(shì)微生物。在新窖泥中一般是乳桿菌目（Lactobacillales）和芽孢桿菌目（Bacillales）為優(yōu)勢(shì)微生物，而老窖泥中為（梭菌目Clostridiales）。而且隨著窖泥的老熟，Lactobacillales和Bacillales的豐度逐漸減少，而Clostridiales的豐度逐漸增加。窖泥中的古菌主要是甲烷菌，有氫營養(yǎng)性和乙酸營養(yǎng)性的甲烷菌，而且隨著窖泥的老熟甲烷菌的豐度也是逐漸增加的。窖泥微生物的Shannon（香農(nóng)）多樣性指數(shù)多在1.50～3.00。

至于真菌，窖泥的數(shù)量較少，有研究發(fā)現(xiàn)，有四個(gè)門，子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和壺菌門（Chytridiomycota），Ascomycota為優(yōu)勢(shì)微生物，新窖泥中根霉（Rhizopus）、莖點(diǎn)霉（Phoma）和絲孢酵母屬（Trichosporon）豐度較高，老窖泥中曲霉（Aspergillus）和假絲酵母（Candida）豐度較高。Candida在窖泥老熟過程中豐度增加明顯。

以上可以看出，DGGE技術(shù)的應(yīng)用確實(shí)加深窖泥微生物群落的認(rèn)識(shí)，但是DGGE技術(shù)本身的缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。DGGE技術(shù)的信息量較少[27]，這也能從窖泥微生物多樣性Shannon指數(shù)看出，最高只能到3.00左右，對(duì)微生物群落的認(rèn)識(shí)還不全面，只能認(rèn)識(shí)到一些豐度非常高的微生物，而且不能同時(shí)對(duì)細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌進(jìn)行分析。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，高通量測(cè)序技術(shù)在窖泥微生物中的應(yīng)用是越來越廣泛。一般是先提取樣本總DNA，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建庫，然后對(duì)16S rDNA/rRNA的V3、V4等高變區(qū)序列進(jìn)行高通量測(cè)序，見表2。

表2 基于16S rDNA/rRNA基因高通量測(cè)序的窖泥微生物群落Table 2 Microbial community in pit mud based on 16S rDNA/rRNA gene high throughput sequencing

續(xù)表

由表2可知，檢測(cè)到的微生物種群數(shù)量大大增加，一般獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目在400～700甚至更多，微生物的Shannon多樣性指數(shù)也一般在3.50～7.00，甚至更高。進(jìn)一步明確了窖泥中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的厚壁菌門微生物，其他優(yōu)勢(shì)微生物還有廣古菌門，擬桿菌門微生物等。優(yōu)質(zhì)老熟窖泥的優(yōu)勢(shì)微生物，在綱水平一般為梭菌綱（Clostridia），在屬水平一般有梭菌屬（Clostridium）、己酸菌屬（Caproiciproducens）、沉積微生物屬（Sedimentibacter）、堿棒菌（Alkalibaculum）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）等。優(yōu)質(zhì)老熟窖泥中的古菌一般為氫營養(yǎng)型的甲烷菌，甲烷桿菌屬（Methanobacterium），甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）。窖泥老熟過程中，產(chǎn)己酸的微生物豐度一般會(huì)逐漸增加（Clostridium、Caproiciproducens），甲烷菌Methano brevibacter豐度也會(huì)同步增加，而乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度會(huì)逐漸下降。

以上研究中有相同點(diǎn)，但是也有很多不同的地方，不同地區(qū)、不同廠家的取樣地點(diǎn)、不同窖齡的窖泥樣品可能會(huì)對(duì)窖泥微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但是窖泥測(cè)序中所用不同引物，也會(huì)對(duì)微生物的檢出有很大影響，如有細(xì)菌和古菌的通用引物（515F和806R），可以同時(shí)檢測(cè)出古菌和細(xì)菌，有細(xì)菌專用引物341F和806R，古菌專用引物519F和915R等。

3 基于組學(xué)技術(shù)對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)

以上研究中雖然對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)比傳統(tǒng)技術(shù)方法更加全面深刻，但是所用樣品的DNA都要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，在此過程中PCR擴(kuò)增條件（如擴(kuò)增效率、膠濃度、電泳條件等）以及PCR技術(shù)本身的缺陷（如很難檢出微生物總量低的微生物）[27]，都會(huì)對(duì)微生物群落的檢出及認(rèn)識(shí)產(chǎn)生影響。因此為了進(jìn)一步深入研究窖泥微生物，揭示窖泥老熟的機(jī)制，宏基因組學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于窖泥微生物的研究。目前對(duì)窖泥微生物研究應(yīng)用到的組學(xué)技術(shù)主要有宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)。宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)都是先提取窖泥中總DNA或RNA，不經(jīng)過PCR擴(kuò)增，直接進(jìn)行高通量測(cè)序，然后進(jìn)行分析。宏基因組學(xué)可以研究某一環(huán)境條件下微生物群落的整體結(jié)構(gòu)信息，而宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以研究一定時(shí)期群體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型及拷貝數(shù)，既研究在特定時(shí)期、特定環(huán)境條件下所有活躍的微生物群體[38-39]。宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)除了研究微生物群落結(jié)構(gòu)外，還可以預(yù)測(cè)研究群體微生物的各種功能，例如比較不同窖泥樣品中微生物特定功能基因的差別以及所表達(dá)酶的差別等。兩種技術(shù)分別從DNA和RNA水平更全面精細(xì)地展示整個(gè)群落的功能代謝譜和表達(dá)譜，進(jìn)而從原理上闡明微生物群落在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的根本機(jī)制。

兩種技術(shù)在窖泥研究中都已經(jīng)開始應(yīng)用。GUO M Y等[40]利用宏基因組學(xué)對(duì)不同地區(qū)不同窖齡窖泥研究發(fā)現(xiàn)，主要的微生物群落組成為：Firmicutes（54.6%），Euryarchaeota（15.3%），Bacteroidetes（10.1%），γ-變形菌門（Gammaproteobacteria 5.8%），后鞭毛生物（Opisthokonta 5.7%）和未分類細(xì)菌（Unclassified_Bacteria 2.3%）。在133個(gè)主要的屬中活躍的微生物有Lactobacillus、Sedimentibacter、Syntrophomonas、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、Methanobacterium、Bacillus、Clostridium、耐堿酵母屬（Galactomyces）、Candida、畢赤酵母屬（Pichia）、青霉菌屬（Penicillium）、Aspergillus，為合成濃香型白酒揮發(fā)性香味物質(zhì)的主要微生物。Bacteroidetes在不同窖齡窖池中差別很大，窖齡越老，豐度越高。Euryarchaeota能顯著表現(xiàn)出酒的地理特征。

TAO Y等[41]利用宏基因組和高通量測(cè)序技術(shù)研究了25年和50年窖泥中活躍微生物，原核微生物為主占95.3%，而真核微生物豐度僅為1.8%。在所有的可讀宏基因組序列中，主要的原核微生物豐度分別為Firmicutes（擬桿菌門）48.0%，廣古菌門（Euryarchaeota）19.0%，Bacteroidetes13.5%，放線菌門（Actinobacteria）2.5%，變形菌門（Proteobacteria）2.1%。并結(jié)合16S rDNA和16S rRNA分析，Clostridial clusterIV，Lactobacillus，喜熱菌屬（Caloramator），Clostridium，Sedimentibacter，Bacteroides，卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）是活躍微生物。Clostridial clusterIV和Clostridium非常可能參與了己酸和合成。在窖泥宏基因組中檢測(cè)到了通過擴(kuò)鏈反應(yīng)合成己酸的大部分酶的基因，還檢測(cè)到了氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型甲烷菌合成甲烷的關(guān)鍵酶基因，推測(cè)出己酸合成過程中存在種間氫轉(zhuǎn)移。

張倩穎[42]對(duì)老熟窖泥進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中雖然廣古菌門（Euryarchaeota）的豐度低于厚壁菌門（Firmicutes），但是mRNA轉(zhuǎn)錄活性遠(yuǎn)高于厚壁菌門；在屬水平mRNA轉(zhuǎn)錄活性較高的為甲烷囊菌屬與甲烷八疊球菌屬。在老熟窖泥微生物中，碳水化合物代謝最為活躍，主要由梭菌綱（Clostridia）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）微生物參與。老熟窖泥中乳酸含量較低的重要原因是因?yàn)長-乳酸脫氫酶活性低，丙酮酸在老熟窖泥中代謝生產(chǎn)的乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）遠(yuǎn)多于乳酸。而對(duì)于乳酸菌和合成來說，耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）有利于L-乳酸合成，而古甲烷八疊球菌屬和甲烷囊菌屬則有利于D-乳酸的合成。

張應(yīng)剛[43]同時(shí)利用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)老熟窖泥研究發(fā)現(xiàn)如下：高表達(dá)物種有Methanoculleus、Clostridium、嗜蛋白質(zhì)菌屬（Proteiniphilum）、Syntrophomonas和Lactobacillus。Lactobacillus的豐度雖然低，但是在窖泥中發(fā)揮了非常重要的作用。所有注釋到的產(chǎn)甲烷菌在窖泥中都是屬于活躍表達(dá)的。己酸的合成代謝在窖泥中非?；钴S。窖泥中存在大量與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌互營的，并且高表達(dá)的微生物：Syntrophomonas、互營熱菌屬（Syntrophothermus）和Syntrophaceticus。窖泥中存在以甲醇為底物合成甲烷的代謝途徑。

從以上研究可以看出，利用組學(xué)技術(shù)除了對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析外，還對(duì)微生物群落的各種功能進(jìn)行了研究。而對(duì)于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)來說，雖已應(yīng)用，但是還存在技術(shù)難題，窖泥RNA的提取非常困難。窖泥成分復(fù)雜，富含腐殖質(zhì)，而且主要以厭氧微生物為主，這些都可能是影響RNA的因素。特別是腐殖質(zhì)對(duì)RNA的提取有很大的影響[44]。

蛋白質(zhì)組學(xué)可以研究窖泥微生物的功能基因表達(dá)、特殊功能蛋白質(zhì)開發(fā)以及生態(tài)元素循環(huán)等，應(yīng)用較少，但開始有人利用此技術(shù)對(duì)窖泥微生態(tài)進(jìn)行研究，如ZHENG Q等[45]首先從30年和300年的窖泥微生物中提取總蛋白質(zhì)和DNA，然后利用基于iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)研究微生物表達(dá)形成香味的功能蛋白質(zhì)。在檢測(cè)到的63種表達(dá)功能香味成分的蛋白中，有59種在300年窖泥中高效表達(dá)。這些功能蛋白在己酸、丁酸和甲烷的代謝途徑中都有表達(dá)。通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)Methanobacterium是一種非常重要的生成香味成分的微生物。

綜合以上研究可以看出，隨著新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，窖泥中發(fā)現(xiàn)的微生物越來越多，窖泥是一個(gè)非常重要的微生物資源寶庫。老窖泥中的標(biāo)志性優(yōu)勢(shì)微生物，在門水平為Firmicutes，Euryarchaeota，Bacteroidetes，在綱水平為梭菌綱Clostridia，在屬水平Clostridium、Sedimentibacter、Syntrophomonas、Methanobacterium，Methanobrevibacter等。甲烷菌除了對(duì)窖泥的老熟有促進(jìn)作用外，對(duì)濃香型白酒的香味物質(zhì)的生成也有重要作用。

4 環(huán)境因子對(duì)窖泥微生物的影響

以上的研究多是從窖泥本身的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和功能進(jìn)行研究。但是在窖池中，窖泥中的微生物是不斷受外界環(huán)境的影響的。長期受到這種環(huán)境影響，窖泥才能從新窖泥逐漸老熟，其中微生物也在不斷的變化中，從最初的群落結(jié)構(gòu)，變成老熟狀態(tài)的群落結(jié)構(gòu)。如果窖池維護(hù)不當(dāng)，對(duì)窖泥有利的環(huán)境條件發(fā)生變化，窖泥就會(huì)出現(xiàn)退化，微生物群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變。同時(shí)這種影響是相互的，窖泥微生物群落的不斷變化，其代謝產(chǎn)物也不斷影響窖池內(nèi)糟醅中香味物質(zhì)，最終會(huì)對(duì)酒質(zhì)產(chǎn)生影響。

窖泥的環(huán)境因子包括水分、pH、酸度、腐殖質(zhì)、有效鉀、有效磷、水解氮、有機(jī)酸等。LIU M K等[36]研究認(rèn)為，pH值、己酸和丁酸與優(yōu)質(zhì)窖泥的呈正相關(guān)性，而乳酸與較差的窖泥樣品呈正相關(guān)性。己酸與丁酸與Caproiciproducens和Clostridium的豐度具有非常明顯的正相關(guān)性，而與Lactobacillus和Bacillus的豐度有非常明顯的負(fù)相關(guān)性。乙酸與Rummeliibacillus、Sporolactobacillus的豐度呈負(fù)相關(guān)性。

陶勇等[46]認(rèn)為環(huán)境因子中有效磷、氨氮、pH 對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大，其次是腐殖質(zhì)，而水分含量的影響較小。而在另一研究中[34]，乳酸主要與1年窖泥樣品微生物呈正相關(guān)，而己酸與25年和50年窖泥樣品微生物呈正相關(guān)。水分、腐殖質(zhì)、氮等與微生物群落變化的相關(guān)性不明顯。pH、NH+4與Bacteroidetes和Euryarchaeota正相關(guān)，而與厚壁菌門負(fù)相關(guān)；而乳酸與丁酸相反。pH、NH+4的增加與己酸含量的增加相一致，而與乳酸及Lactobacillus的豐度增加相反。

胡曉龍[47]的研究認(rèn)為，窖泥中乳酸與水溶性有機(jī)碳含量及窖泥中乳酸菌（Lactobacillus及Pediococcus）的相對(duì)含量呈正相關(guān)，而大多數(shù)甲烷菌及梭菌綱微生物與窖泥中pH值呈現(xiàn)正相關(guān)。

5 存在的問題及展望

雖然利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)窖泥微生物的認(rèn)識(shí)有了更多的了解，但還依然有很多問題沒有解決。

窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系依然不明確。窖泥微生物群落里面的微生物群落如何相互作用，又如何影響其功能，這是研究窖泥老熟的機(jī)制的前提和基礎(chǔ)，只有弄清楚了窖泥微生物的作用和功能，才能了解窖泥微生物群落從新窖泥如何逐漸適應(yīng)環(huán)境變成老熟窖泥，才能了解窖泥老熟機(jī)制。

窖泥雖然是決定濃香型白酒風(fēng)格的關(guān)鍵，但是窖泥到底如何影響白酒的香味成分，不是十分明確。濃香型白酒的關(guān)鍵香味物質(zhì)，是在窖泥中合成然后進(jìn)入糟醅，還是窖泥微生物通過黃水進(jìn)入糟醅在合成香味物質(zhì)，或者兩者兼而有之，這對(duì)白酒關(guān)鍵香味物質(zhì)的生成非常重要，值得進(jìn)一步研究。

在正常生產(chǎn)中，窖池窖泥長期處在厭氧、高二氧化碳濃度、富含乙醇、有機(jī)酸的環(huán)境下，這種環(huán)境對(duì)窖泥微生物應(yīng)該有非常大的影響，正是這種環(huán)境造成了窖泥的逐步老熟。但是那種環(huán)境因子起什么作用，如何促進(jìn)窖泥老熟，需要深入研究。

現(xiàn)在對(duì)窖泥的評(píng)價(jià)，依然沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在目前的生產(chǎn)中還是經(jīng)常以時(shí)間的長短、感官、產(chǎn)酒指標(biāo)來判斷窖泥的好壞。但是這些判定都存在不確定性，沒有明確的界限，無法數(shù)據(jù)化，只能靠經(jīng)驗(yàn)。這是因?yàn)榻涯嗟某墒爝^程受到窖泥樣品本身在窖池中的位置、狀態(tài)、時(shí)間長短、維護(hù)以及白酒生產(chǎn)工藝等各種因素的影響。有些學(xué)者也嘗試用一些理化指標(biāo)來評(píng)價(jià)窖泥狀態(tài)，但依然有局限性[48-49]。如果明確了微生物在窖泥中的分布和功能，可以把微生物作為評(píng)價(jià)窖泥狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，更有利于對(duì)窖泥的評(píng)價(jià)。