基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血的分子機(jī)制＊

周文靜，張 萌，周榮榮，趙 樂，李志勇，2，王永輝，李艷彥＊＊

（1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 晉中 030619；2. 中央民族大學(xué)藥學(xué)院 北京 100081）

角藥是基于辨證論治原則與中藥藥性理論，由三味具有相互促進(jìn)或相反相成作用的中藥聯(lián)合配伍而成[1]。角藥作為中藥方劑具體配伍形式，在擴(kuò)大藥物使用范圍、協(xié)同增效、減毒增效等方面發(fā)揮著重要的作用[2]。

黃芪，甘、微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒斂瘡、利水消腫等功效，素有“補(bǔ)氣圣藥”之稱[3]。當(dāng)歸，味甘、辛，性溫，歸肝、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功效，為“補(bǔ)血要藥”[4]。黃芪與當(dāng)歸配伍構(gòu)成經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯，李東垣在《內(nèi)外傷辨惑論》卷中提出凡屬血虛氣弱者，均可以當(dāng)歸補(bǔ)血湯加減應(yīng)用[5]。為增強(qiáng)其補(bǔ)氣養(yǎng)血效果，加入平補(bǔ)氣血之大棗。大棗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神之功，是少有的具有補(bǔ)氣養(yǎng)血兩者功效的單味中藥[6]。黃芪、當(dāng)歸配伍大棗，大棗既可增強(qiáng)黃芪補(bǔ)氣之功，又能增加當(dāng)歸養(yǎng)血之效，構(gòu)成補(bǔ)氣養(yǎng)血的角藥。同時(shí)，黃芪是2018 年國(guó)家衛(wèi)健委新增的藥食同源藥，當(dāng)歸除藥用外，可用于藥膳當(dāng)中或作為天然調(diào)味香料使用，大棗是常用的藥食同源藥材，歷史悠久。因此，“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥一方面可作為治療氣血兩虛證的常用藥物組合，另一方面可作為開發(fā)相關(guān)功能食品的原料，應(yīng)用范圍廣泛。

雖然“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血的作用明確，但是從分子層面上系統(tǒng)的分析其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，尚未見相關(guān)論述和報(bào)道。近年來，興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，其整體性、系統(tǒng)性的研究特點(diǎn)與中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的作用特點(diǎn)相吻合[7]，適合探究復(fù)方中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，被廣泛應(yīng)用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子層面預(yù)測(cè)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血的物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的可靠性，以期為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，為藥食同源藥物研究提供方法思路。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB） ≥ 30%、類 藥 性（Druglikeness，DL）≥0.18為前提篩選黃芪、當(dāng)歸和大棗的化學(xué)成分。

1.2 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

進(jìn)一步在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成人源（Homo sapiens）基因靶點(diǎn)名稱，剔除重復(fù)項(xiàng)。

1.3 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將以上收集的“中藥-成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入Cytoscape 3.2.1 軟件，利用Network Analyzer 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，按度值degree 值取其中位數(shù)。將篩選的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org），獲得靶點(diǎn)蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)，保存為TSV 格式，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，根據(jù)degree 值的大小篩選出核心靶點(diǎn)，進(jìn)行可視化展示，進(jìn)一步獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）將篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。設(shè)置參數(shù)P＜0.05，考察“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥作用靶點(diǎn)的生物過程、分子功能和細(xì)胞組分及生物學(xué)通路，并根據(jù)富集程度和P值，將排名前20 位利用Graph Pad Prism 5 繪圖。使用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”完整網(wǎng)絡(luò)。通過KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG mapping 獲取相關(guān)通路圖。

1.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 造模與給藥

選取SPF 級(jí)KM 小鼠30 只（購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SCXK（京）2016-0011），7周齡左右，體重18±4 g，雌雄各半，分為正常組、模型組和治療組。除正常組外其余各組在第1 d 與4 d 按照0.2 mg·kg-1皮下注射2%乙酰苯肼（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：R017768），按照0.3 mg·kg-1每天一次腹腔注射1%環(huán)磷酰胺（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：R014054），正常組在同時(shí)間點(diǎn)僅腹腔注射等體積生理鹽水。同時(shí)，除正常組每天給予飼料外，其余各組在第1 d 飽食后禁食兩天，第4 d 再給飼料，以構(gòu)建氣血兩虛小鼠模型[8-10]。第五天開始治療組灌以“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥，按照當(dāng)歸補(bǔ)血湯黃芪與當(dāng)歸比例為5∶1，并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取黃芪10 g，當(dāng)歸2 g，大棗8 g 水煎劑，濃度為2.5 g·mL-1，按照0.02 ml·g-1一日一次灌胃，連續(xù)六天，正常組與模型組灌以相應(yīng)劑量的蒸餾水。觀察小鼠的一般狀態(tài)，小鼠末次給藥后，禁食，取全血抗凝備用。

1.5.2 小鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)測(cè)定

末次給藥后，稱取小鼠體重并做好記錄，頸椎脫臼處死小鼠后，取整個(gè)胸腺和脾臟，用生理鹽水沖洗，濾紙瀝干，電子天平稱重，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。計(jì)算公式：胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.5.3 外周血象檢測(cè)

采用血液分析儀檢測(cè)各組小鼠外周血紅細(xì)胞（Red blood cell，RBC）、血紅蛋白（Haemoglobin，HGB）的數(shù)量。

1.5.4 Real-time PCR檢測(cè)PTGS2mRNA表達(dá)

前列腺素合成酶2（PTGS2）mRNA 檢測(cè)，按照Trizol 試劑（北京聚合美生物科技有限公司，批號(hào)MF11501）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR 采用Light Cycler?480 II 系統(tǒng)，步驟為：變性95 ℃，15 s；退火56 ℃，30 s；延伸72 ℃，20 s；共擴(kuò)增44個(gè)循環(huán)。引物序列為：PTGS2 上游5'-TGAGCAAC?TATTCCAAACCAGC-3'，下游5'-GCACGTAGTCTTC?GATCACTATC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為74 bp；GAPDH 上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下 游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為123 bp。結(jié)果處理用ΔΔCT 法：A = CT（目的基因，待測(cè)樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本）；B = CT（目的基因，對(duì)照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本），K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K來計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。分析得出各個(gè)樣 品量 的 循環(huán) 閾值（Ct），用2-ΔΔCt公式 計(jì)算PTGS2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.5 ELISA法檢測(cè)TNF-α的含量

取各組的肝素抗凝血漿嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司，批號(hào)MF821）操作步驟，測(cè)定血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選得到黃芪87 個(gè)、當(dāng)歸69個(gè)和大棗133 個(gè)化學(xué)成分，進(jìn)一步按照OB，DL 參數(shù)篩選得黃芪20個(gè)，主要為黃芪多糖類、皂苷類、黃酮類及醇類等；當(dāng)歸5 個(gè)，主要為揮發(fā)油類、多糖類、甾體類等；大棗25個(gè)，主要為皂苷類、生物堿類、甾體類、黃酮類等化合物，獲得“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥化學(xué)成分47個(gè)，其中共有成分3個(gè)，見表1。

2.2 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

為了揭示“黃芪-當(dāng)歸-大棗”防治氣血兩虛證的分子機(jī)制，預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)黃芪206 個(gè)、當(dāng)歸53 個(gè)、大棗204 個(gè)，中藥兩兩之間均具有不同數(shù)量的共同靶點(diǎn)，說明其之間存在某些相互協(xié)同的作用關(guān)系（見圖1），進(jìn)一步分析三藥共有靶點(diǎn)有43 個(gè)，分別為TGFB1、

SLC6A4、SLC6A3、SLC6A2、SCN5A、RXRA、PTGS2、PTGS1、PLAU、PIK3CG、PDE3A、PGR、OPRM1、NCOA2、FOS、KCNH2、JUN、AKT1、HTR2A、GABRA5、GABRA3、GABRA2、GABRA1、EGFR、EGF、CXCL8、ESR1、DRD1、CHRM4、CHRM2、CHRM1、CASP9、CASP8、CASP3、BCL2、BAX、AKR1B1、ADRB2、ADRB1、ADRA1B、ADH1C、IL6 和ERBB2。黃芪、當(dāng)歸、大棗雖然單味藥作用廣泛，但配伍組合后為補(bǔ)氣養(yǎng)血重要組合，由此推測(cè)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥可能通過這些共有靶點(diǎn)發(fā)揮補(bǔ)氣養(yǎng)血的協(xié)同作用。

2.3 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

圖1 黃芪、當(dāng)歸、大棗共有靶點(diǎn)韋恩圖

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋎egree 值由大到小排列，按中位數(shù)取221 個(gè)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥作用靶點(diǎn)，輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)，選degree值前100位的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，并進(jìn)行可視化展示（見圖2），圖中越接近紅色表明網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)越大，即degree值 越 大。 排 名 前10 位 的 包 括：AKT1（RACalphaserine/threonine-proteinkinase，RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、IL6(Interleukin-6，白細(xì)胞介素-6)、FOS（Proto-oncogenec-Fos，原 癌 基 因c-Fos）、ESR1（Estrogen receptor1，雌 激 素 受 體 1）、PTGS2（Prostaglandin G/H synthase 2，前列腺素G/H 合成酶2）、EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體）、EGF（Pro-epidermal growth factor，表皮生長(zhǎng)因子）、CASP3（Caspase-3，半胱天冬蛋白酶3）、JUN（Jun proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit，

Jun 原癌基因/AP-1 轉(zhuǎn)錄因子亞單位）、ERBB2（Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2，紅細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物2）?？梢园l(fā)現(xiàn)這10 個(gè)靶點(diǎn)均為三藥共有靶點(diǎn)，可能是角藥發(fā)揮補(bǔ)氣養(yǎng)血作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，且網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相互相連，說明靶點(diǎn)之間的關(guān)系密切，存在相互協(xié)同的作用。

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析

對(duì)篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體、胞液；參與免疫應(yīng)答，神經(jīng)元凋亡過程負(fù)調(diào)控、血管收縮正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生物過程；并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、血紅素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、過氧化物酶、α-腎上腺素能受體等分子功能發(fā)揮補(bǔ)氣養(yǎng)血作用，主要涉及癌癥（胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌）信號(hào)通路，TNF、P53、Foxo、HIF-1 信號(hào)通路，鈣信號(hào)通路以及感染性疾病信號(hào)通路等，見圖3。

表1 “黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥部分化學(xué)成分的基本信息

圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 GO功能和KEGG通路富集分析

圖4 “中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

圖5 TNF信號(hào)通路

為了更好的解釋化學(xué)成分與相應(yīng)靶點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)信號(hào)通路之間復(fù)雜的作用關(guān)系，將KEGG 通路富集分析前20 位結(jié)果繪制“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（見圖4），可以發(fā)現(xiàn)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥多種藥物化學(xué)成分對(duì)應(yīng)多種作用靶點(diǎn)，多種靶點(diǎn)又映射于不同通路，體現(xiàn)其多成分、多靶點(diǎn)、多通路和整合調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)。進(jìn)一步以TNF 信號(hào)通路為例，從KEGG mapping 獲取TNF 信號(hào)通路圖（見圖5），紅色部分為“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥的作用靶點(diǎn)，得到有15個(gè)靶點(diǎn)通過調(diào)節(jié)其中多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。

2.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠毛色柔順光亮，活動(dòng)靈活，爪子、耳朵呈正常淡紅色，攝食、飲水量正常。模型組小鼠毛發(fā)易脫落，缺少光澤，活動(dòng)減少、扎堆、倦臥，爪子、耳色顏色偏淡，飲水、攝食量減少。治療組小鼠精神好轉(zhuǎn)，毛發(fā)恢復(fù)柔順，耳色，爪子顏色恢復(fù)淡紅色，攝食、飲水量逐漸趨于正常。同時(shí)，與正常組比較，模型組小鼠的體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，治療組小鼠的體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與空白組比較，模型組RBC、HGB 數(shù)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，治療組RBC、HGB 數(shù)量明顯升高（P＜0.01）（見表2）。這表明氣血兩虛證模型小鼠造模成功，且“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥對(duì)氣血兩虛小鼠有一定治療作用。

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、RBC、HGB檢測(cè)結(jié)果（± s，n = 10）

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、RBC、HGB檢測(cè)結(jié)果（± s，n = 10）

注：與正常組比較*P ＜0.01；與模型組比較▲P ＜0.01

HGB/(g·L-1)161.08±6.99 96.22±5.67*137.56±5.86▲組別正常組模型組治療組體重/g 32.17±2.30 22.31±2.47*29.00±2.01▲胸腺指數(shù)/(mg·g-1)2.32±0.23 0.85±0.15*1.92±0.30▲脾臟指數(shù)/(mg·g-1)3.84±0.84 2.30±0.05*3.28±0.92▲RBC/(1012·L-1)9.26±0.42 4.20±0.27*8.21±0.16▲

表3 各組PTGS2、TNF-α檢測(cè)結(jié)果(± s，n = 10）

表3 各組PTGS2、TNF-α檢測(cè)結(jié)果(± s，n = 10）

注：與正常組比較*P ＜0.01；與模型組比較▲P ＜0.01

TNF-α/(ng·L-1)37.68±4.02 64.58±5.05*40.52±4.89▲組別正常組模型組治療組PTGS2/(2-ΔΔCT)1.21±0.45 6.03±0.67*2.56±0.76▲

進(jìn)一步從TNF 信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，PTGS2 是“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥的作用于此通路預(yù)測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，且未見氣血兩虛證中PTGS2 在TNF 通路中表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道，本研究選取PTGS2 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組PTGS2mRNA 表達(dá)水平與TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組PTGS2mRNA 表達(dá)水平，TNF-α含量明顯降低（P＜0.01）（見表3）。表明“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥可能通過調(diào)控PTGS2mRNA 表達(dá)，降低TNF-α釋放，進(jìn)而抑制TNF 信號(hào)通路的激活，發(fā)揮對(duì)氣血兩虛小鼠的治療作用，進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性。

3 討論

氣血兩虛證屬于中醫(yī)證候，是指由于素體脾胃虛弱，或飲食不節(jié)，或久病大病失養(yǎng)，亦或因產(chǎn)時(shí)產(chǎn)后，導(dǎo)致氣血兩虛，表現(xiàn)為面色萎黃或淡白，頭暈?zāi)垦＃贇鈶醒?，神乏力，或有自汗，心悸失眠，舌質(zhì)淡嫩，脈細(xì)弱等[11]。氣血兩虛證可見于癌癥、手術(shù)后、貧血、產(chǎn)后腹痛等多種疾病?！包S芪-當(dāng)歸-大棗”角藥作為補(bǔ)氣養(yǎng)血的重要組合，既可藥用，對(duì)于輕度氣血兩虛者又可食療，作用廣泛。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥化合物47 個(gè)，共有成分為槲皮素（Quercetin）、丁子香萜（Mairin）和豆甾醇（Stigmasterol），預(yù)測(cè)得到共有靶點(diǎn)43 個(gè)。三藥之間存在共同成分、共同靶標(biāo)，說明合用可起到協(xié)同增效的作用，充分體現(xiàn)多成分，多靶點(diǎn)的協(xié)同作用特點(diǎn)。

進(jìn)一步分析，得到“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血 關(guān) 鍵 靶 點(diǎn)10 個(gè)，包 括AKT1、IL6、FOS、ESR1、PTGS2、EGFR、EGF、CASP3、JUN 和ERBB2。AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與腫瘤、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病發(fā)生相關(guān)[12]。FOS 與JUN 家族的蛋白以同源或異源二聚體的形式結(jié)合形成AP-1，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、增殖等活動(dòng)，原癌基因蛋白c-fos 和c-Jun在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[13]。ESR1（雌激素受體1）是雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)生物學(xué)效應(yīng)的主要介導(dǎo)者，參與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和骨質(zhì)疏松癥等疾病的病理過程[14]。EGF 是一種多肽類生長(zhǎng)因子[15]，EGFR 為原癌基因C-erbB 表達(dá)產(chǎn)物，與EGF 特異性結(jié)合后，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖，形成機(jī)體上皮組織增生[16]，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR 與EGF 的高表達(dá)或異常表達(dá)。已有研究報(bào)道，氣血兩虛型胃癌癌前病變存在EGFR 高表達(dá)[17]，氣血兩虛型胃癌血清中EGF 明顯升高[18]。而ERBB2 為EGF 受體家族成員之一[19]，研究發(fā)現(xiàn)，C-erBb-2 蛋白的陽(yáng)性率在胃癌不同中醫(yī)證型之間存在差異，其中氣血兩虛型陽(yáng)性率達(dá)63.2%[20]。CASP3 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。PTGS2為前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶，參與炎癥和有絲分裂形成的前列腺樣生物合成[21]。多功能細(xì)胞因子IL-6，在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22]。可以發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)主要為一些轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和過氧化物酶等，在免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，疾病方面主要富集于癌癥。氣血兩虛證是癌癥常見的證型，中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，惡性腫瘤的發(fā)病有多種因素，總體來說是因虛發(fā)病，其中以氣虛質(zhì)發(fā)病最高[23]，而氣虛常伴隨血虛，形成氣血兩虛證。“邪之所湊，其氣必虛”，腫瘤放療或化療等術(shù)后亦會(huì)出現(xiàn)氣血兩虛證[24]。推測(cè)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥一定程度可作為防治癌癥的藥物組合或食療方。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥主要介導(dǎo)癌癥信號(hào)通路，TNF、P53、Foxo、HIF-1 信號(hào)通路，鈣信號(hào)通路等發(fā)揮補(bǔ)氣養(yǎng)血的作用。選取KEGG 通路排名前20 位構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，可以發(fā)現(xiàn)“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥作用多靶點(diǎn)映射于不同通路。本研究以TNF 信號(hào)通路為例，選取“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥作用于此通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)PTGS2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。PTGS2 是前列腺素合成起始步驟的關(guān)鍵酶，其負(fù)責(zé)催化產(chǎn)生PGE2 等炎癥介質(zhì)，從而擴(kuò)張血管、提高血管通透性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。TNF-α是一類具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，其通過和細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，調(diào)亡及誘發(fā)炎癥等生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α屬于TNF家族，可以激活TNF 信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒性，炎性反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[25]。通過建立氣血兩虛小鼠模型，治療組灌胃以“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥水煎劑，結(jié)果顯示：模型組小鼠PTGS2mRNA表達(dá)、TNF-α含量明顯升高（P＜0.01），治療組PTGS2mRNA表達(dá)、TNF-α含量明顯降低（P＜0.01），說明“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥可能通過降低PTGS2mRNA 表達(dá)，減少TNF-α的釋放，進(jìn)而抑制TNF 信號(hào)通路的激活而發(fā)揮補(bǔ)氣養(yǎng)血的作用。進(jìn)一步證實(shí)了，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)得到的“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血可能的分子機(jī)制，確保方法和所得結(jié)論的可靠性。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血作用的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、生物過程和信號(hào)通路，形成“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”的完整作用過程，并加以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。體現(xiàn)了“黃芪-當(dāng)歸-大棗”通過多成分、多靶點(diǎn)和多通路發(fā)揮治療作用的特點(diǎn)，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)，為藥食同源藥物研究提供方法思路。