三七醇提物對秀麗隱桿線蟲的降脂作用＊

黃 壯，李 靜，杜鴻志，韓林濤，洪 怡，黃必勝，曹 艷

（湖北中醫(yī)藥大學藥學院 省部共建中藥資源和中藥復方教育部重點實驗室 武漢 430065）

三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]為五加科多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴的中藥材，藥用部分主要為根莖，至今已有六百多年的用藥歷史。三七，味甘、微苦、性溫，具有化瘀止血，活血定痛的功效。主治出血證，跌打損傷，瘀血腫痛。歸肝經(jīng)、胃經(jīng)、心經(jīng)、肺經(jīng)、大腸經(jīng)[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，三七具有活血止血、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、改善記憶、促進生長發(fā)育、抗疲勞、降血脂等多種藥理活性[2-4]。據(jù)報道臨床使用中，三七單味藥使用或與其他中藥配伍使用，均表現(xiàn)出一定的降脂作用[5-6]。據(jù)動物實驗及臨床觀察結(jié)果表明，三七有較為明確的降脂效果，但涉及其降脂作用機制的研究尚未見報道。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱C.elegans）屬于線性動物門線蟲綱，是一種全身透明，以細菌為食，廣泛自由生活在土壤里的無脊椎動物。秀麗線蟲體型小，生命周期短，后代繁殖量大，線蟲可進行同步化處理，保持一致性，提高可比性；秀麗線蟲是一個完整的生命體，有著簡單但完善的神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，與人類基因有較高的同源性[7]。秀麗線蟲的消化道由咽和腸兩部分組成，是脂類物質(zhì)沉積的主要場所，由于線蟲蟲體透明，在顯微鏡下可以很清楚的觀察到從頭部到尾部的整個腸道狀況。因此，秀麗隱桿線蟲作為研究脂肪代謝與分子機制的重要模型，符合動物實驗3R 原則[8]，有著其他模式生物不可比擬的優(yōu)勢，目前秀麗隱桿線蟲作為模式生物已廣泛應用于脂質(zhì)的代謝研究。線蟲表皮和腸上皮細胞中存在多種脂質(zhì)合成和催化酶，線蟲主要在皮下和腸道細胞儲存脂肪，可與脂質(zhì)親和性染料結(jié)合并被染色，如尼羅紅、油紅O 等染料，通過穿過線蟲透明體的染料積累強度而量化線蟲體內(nèi)的脂肪[9]。其中，油紅O 為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，進而著色，能較好的顯示腸道內(nèi)的脂肪滴。

本研究以秀麗線蟲為模型，觀察三七醇提物對線蟲的壽命、運動行為、生殖等基本生命特征的影響；并采用油紅O 對腸道脂滴進行染色，采用甘油三酯試劑盒法測定線蟲體內(nèi)的甘油三酯水平，以確定三七醇提物的降脂作用；采用RT-PCR 法檢測脂肪代謝相關的基因，以探討三七降脂的作用機制，為三七降脂產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 試劑與儀器

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，野生型N2），大腸桿菌菌株（E.coliOP50），均由華中農(nóng)業(yè)大學動科院胡敏教授惠贈。三七藥材購于湖北強康中藥飲片有限公司，瓊脂糖（西班牙BIOWEST 公司），胰蛋白胨（英國OXOID 公司），油紅O（上海源葉生物科技有限公司），絞股藍總皂苷膠囊（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司），其他試劑均購于生工生物工程股份有限公司。

SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），IX-73P1F型熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），熒 光 定 量PCR 儀（Roche，LightCycler 480II）,體式顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

取適量三七經(jīng)萬能粉碎機粉碎后，采用篩分法過100 目篩，得三七粉。將三七粉加入5 倍量75%乙醇浸泡1 h，40℃超聲提取4次，每次30 min，提取液合并，濃縮，真空干燥，得三七醇提物樣品，置于干燥器中備用[10]，臨用前用M9 緩沖液（適量Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4配制而成）溶解至所需濃度，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。絞股藍總皂苷膠囊作為陽性對照藥，取10 粒（每粒含絞股藍總皂苷60 mg），去囊殼，將囊心物用70%乙醇50℃溫浸2 h，過濾，濾液回收乙醇至終體積為10 mL，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 線蟲同步化

用M9 緩沖液將產(chǎn)卵期線蟲從固體培養(yǎng)基（簡稱NGM 板）洗下，靜置3 min，吸走部分上清，留1 mL，加線蟲裂解液1 mL，渦旋震蕩5-8 min，3000rpm，快速離心2 min，吸走上清，加M9 液洗3-4 遍。25℃，M9 中放置過夜，即同步至L1期。

2.3 壽命實驗

將同步化至L4 期的線蟲分別置于含不同濃度三七醇提物的NGM 板中，終濃度分別為0 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL，每板線蟲約50 條，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時壽命計為day 0，每2 天觀察并計數(shù)各組線蟲的死亡數(shù)，并將存活線蟲轉(zhuǎn)至新板繼續(xù)培養(yǎng)。線蟲死亡評判標準為：無移動、無吞咽動作，且用珀金絲針輕觸也無反應。

2.4 生殖實驗

將線蟲挑至空白板及各含藥板中，每板1條，每組10 板，每24 h 將線蟲轉(zhuǎn)入新的NGM 中，直至排卵期結(jié)束。所有含卵板均在25℃孵育48 h 后再計數(shù)，各板孵出的子代線蟲數(shù)目之和即該線蟲總子代數(shù)[11]。

2.5 抗逆性實驗

熱應激實驗：將線蟲挑至空白板及各含藥板中，于25℃培養(yǎng)，4 天后置于37℃培養(yǎng)，每小時觀察并計數(shù)各組線蟲的生存情況，至所有線蟲全部死亡，線蟲死亡評判標準同壽命實驗[12]。氧化應激實驗：將線蟲挑至空白板及各含藥板中，于25℃培養(yǎng)4天后，將線蟲挑至含終濃度40 mmol/L 過氧化氫（H2O2）的96 孔板中，每孔10 條，每小時觀察并計數(shù)各組線蟲的生存情況，至所有線蟲全部死亡，線蟲死亡評判標準同壽命實驗。

2.6 甘油三酯含量測定

將同步化至L4 期的線蟲分組給藥處理，每組約1000 條，4 d 后，分別用M9 緩沖液洗下，超聲破碎提取甘油三酯，按照甘油三酯檢測試劑盒說明書進行檢測。根據(jù)標準曲線計算所含甘油三脂總量。

2.7 油紅O染色

將同步化至L4期的線蟲給藥處理4 d后，用M9洗下，去上清，加入120 μL 多聚甲醛，混勻，置于4℃，20 min，再轉(zhuǎn)至-80℃，15 min，固定后于40℃水浴解凍1 min，短暫離心去上清，用M9 緩沖液洗3 次，再加入油紅O 染液120 μL，染色2 h，去上清，用M9 緩沖液洗3次，顯微鏡下觀察拍照[13]。

2.8 脂肪相關的基因mRNA 表達水平測試

將同步化至L4 期的線蟲給藥處理4 d 后，破碎蟲體,Trizol 法提取線蟲總RNA，測定總RNA 的濃度及純度后，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cDNA，繼而進行acs-2 mRNA、pod-2 mRNA、fat-5 mRNA 的RT-PCR 含量測定[14-15]。所用的引物序列：acs-2 mRNA 上游引物：5'-AGTGAGACTTGACAGTTCCG-3' ，下 游 引 物：5'-CTTGTAAGAGAGGAATGGCTC-3'；Pod-2 mRNA 上游引物：5'-TATGCGATGCCTGATGACTG-3'，下游引物：5'-TGTCTCCCAAACTGAACATAGC-3'；Fat-5 mRNA

圖1 三七醇提物對秀麗線蟲壽命影響的生存曲線（A）和平均壽命（B）

上游引物：5'-TGAACTGGACCCGAGTATTGA-3'，下游引物：5'-ACAGCCGAACTTCTTGCACT-3'。擴增結(jié)束后計算擴增效率，采用2-ΔΔCT法計算相對基因表達。

2.9 統(tǒng)計學分析

實驗均重復3 次，用SPSS 21.0 軟件分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ONEWAY ANOVA 方差分析；數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，P＜0.05或P＜0.01表示有統(tǒng)計學差異。

3 結(jié)果

3.1 壽命實驗

如圖1所示，各給藥組生存曲線均較對照組右移，表現(xiàn)出延長壽命的作用。與空白對照組相比，0.8 mg/mL組線蟲的平均壽命延長13.69%（P＜0.05），最大壽命值為20 天；1.6 mg/mL 組線蟲平均壽命顯著延長22.07%（P＜0.01），最大壽命值為22 天。且給藥組線蟲的壽命隨著給藥劑量增加而延緩，呈現(xiàn)出劑量依賴關系。

3.2 生殖實驗

通過對線蟲給藥后子代數(shù)的觀察，發(fā)現(xiàn)三七醇提物對線蟲子代總數(shù)無影響。如圖2 所示，各給藥組的子代總數(shù)目與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)，表明在0.8 mg/mL、1.6 mg/mL 劑量下，三七醇提物對線蟲生殖能力均無顯著性影響。

3.3 抗逆性實驗

圖2 三七醇提物對秀麗線蟲生殖能力的影響

為了分析三七醇提物對秀麗隱桿線蟲抗逆性的影響，分別開展了熱應激實驗和氧化應激實驗。與對照組相比，熱應激條件下，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲生存曲線右移，增強線蟲的耐熱能力，結(jié)果見圖3。與對照組相比，三七醇提物0.8 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了25.30%（P＜0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了40.05%（P＜0.01）。與對照組相比，氧化應激條件下，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲生存曲線右移，增強線蟲的抗氧化能力，結(jié)果見圖4。與對照組比較，三七醇提物0.8 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加25.77%（P＜0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲平均壽命增加了35.88%（P＜0.01）。由此可知，三七可顯著增強線蟲對熱應激和氧化應激耐受能力，改善線蟲的抗逆性。

3.4 甘油三酯含量測定

與對照組相比，不同劑量的三七醇提物均能使線蟲體內(nèi)甘油三酯含量下降，但僅高劑量給藥組有顯著性差異；陽性對照藥1.0 mg/mL 絞股藍總皂苷能顯著降低甘油三酯含量，結(jié)果見圖5。0.8 mg/mL 劑量組三七醇提物線蟲使甘油三酯含量下降4.1%（P＞0.05），1.6 mg/mL 劑量組線蟲使甘油三酯水平顯著下降了8.9%（P＜0.05）。

3.5 腸道脂肪含量分析

圖3 熱應激條件下三七對秀麗線蟲生存率的影響;

圖4 氧化應激條件下三七對秀麗線蟲生存率的影響

圖5 三七醇提物對秀麗線蟲總甘油三酯水平的影響

如圖6 A 所示，油紅O 將線蟲腸道脂肪染為紅色，顏色鮮艷并且容易觀察，染色效果良好。對圖片應用ImageJ 軟件進行灰度分析，以量化數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明，用三七醇提物處理的線蟲的脂肪沉積程度明顯低于對照線蟲。與對照組相比，陽性對照藥1.0 mg/mL絞股藍總皂苷處理的線蟲腸道脂質(zhì)含量下降了59.41%（P＜0.05），用三七醇提物處理的線蟲在0.8 mg/mL 和1.6 mg/mL 劑量下的腸道脂質(zhì)含量分別下降了21.20%和52.83%（P＜0.05）；高劑量組與陽性藥比較無顯著差異，表明兩者效果相當（P＞0.05）。

3.6 對秀麗線蟲脂肪代謝相關基因的影響

圖6 三七醇提物對線蟲體內(nèi)脂質(zhì)含量的影響

圖7 三七對秀麗線蟲體內(nèi)的脂肪代謝相關基因表達水平的影響

為了初步探討三七降脂作用的分子機制，研究三七對秀麗線蟲脂肪代謝相關基因的影響，本研究檢測了脂肪代謝相關基因的表達，見圖7。與對照組相比，1.6 mg/mL 三七給藥組線蟲的pod-2、fat-5mRNA 表達水平分別下調(diào)了17.3%、35.1%、acs-2 mRNA 表達水平平均上調(diào)了11.4%（P＜0.05）。

4 討論

在前期研究中，本實驗通過不同劑量三七提取物的給藥觀察，發(fā)現(xiàn)三七提取物在2 mg/mL 以內(nèi)是安全劑量[16]，故本實驗劑量設計兩個有效劑量，分別為0.8 mg/mL、1.6 mg/mL。

實驗劑量的三七提取物對線蟲的壽命有延長作用，而對產(chǎn)卵量沒有顯著影響，且能提高線蟲抗熱應激和抗氧化應激能力[17]，由此表明，三七是一種安全的、具有潛在開發(fā)價值的降脂藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)，三七可降低甘油三酯的含量，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴。并觀察了線蟲腸道脂滴被染色情況，采用油紅O 染色后，通過分析線蟲腸道脂肪紅光密度值變化，確定了三七醇提物能減少秀麗隱桿線蟲脂肪沉積。這表明三七具有顯著降低線蟲腸道脂肪累積的作用，且隨著三七濃度升高，線蟲腸道脂肪含量逐漸降低。

為了探討三七對秀麗線蟲降脂的作用機制，采用了RT-PCR 分析方法對脂肪代謝相關的基因pod-2、fat-5、acs-2 mRNA 的表達水平進行了檢測分析。機體內(nèi)脂肪的調(diào)控是個復雜的過程，據(jù)報道基因acs-2是參與調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化的第一步；pod-2、fat-5 是參與脂肪合成的基因。acs-2 上調(diào)表示脂肪酸氧化增強，pod-2、fat-5 下調(diào)說明脂肪合成量減少[18]。由此可見，三七可通過對脂肪代謝相關基因的調(diào)節(jié)使秀麗線蟲脂肪合成減少，降解增多，從而使體內(nèi)脂肪累積減少。

生物體體內(nèi)的脂肪貯存與利用一般是保持著動態(tài)平衡，機體在復雜的轉(zhuǎn)錄、翻譯及后期加工上對脂肪代謝進行調(diào)控[18]。pod-2 編碼乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase)，催化 乙酰輔 酶A（Acetyl CoA）變成丙二酰輔酶A（Malonyl CoA）是脂肪合成第一步。該類酶也是脂肪酸從頭合成的限速酶；acs-2參與調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化的第一步；fasn-1、fat-5 是與脂肪合成有關的基因。三七醇提取能上調(diào)acs-2，下調(diào)fat-5、pod-2，故從基因表達水平可推斷三七使線蟲體內(nèi)脂肪累積減少。脂肪代謝在機體生理和病理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用，對長期的能量儲存、細胞內(nèi)及細胞間信號傳導和維持細胞膜穩(wěn)態(tài)都有重要的影響。過多的以甘油三酯（TAGs）形式的脂肪儲存，將伴隨著動脈粥樣硬化和二型糖尿病等疾病的發(fā)生，而適度的脂肪儲存則能延長壽命[19-20]，因此，保持脂肪代謝穩(wěn)態(tài)對健康尤為重要。三七一方面表現(xiàn)出降低體內(nèi)甘油三酯水平和減少腸道脂肪累積的作用，同時具有延長秀麗隱桿線蟲壽命、增強抗逆性的作用，由此可推斷，三七不僅有降低脂肪沉積的作用，還可能對機體脂肪代謝穩(wěn)態(tài)具有較好的調(diào)節(jié)作用。

據(jù)前期文獻報道，三七總皂苷對非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠表現(xiàn)出一定的降脂作用，其降脂作用機制跟其能夠降低肝臟中一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）含量有關[3]。三七多糖對秀麗隱桿線蟲具有延長壽命的作用[21]。但也有學者報道，三七總皂苷存對大鼠存在一定的亞慢性毒性作用[22]，因此三七總皂苷口服的安全性問題尚存爭議[23-26]。三七醇提物中，含有多種化學物質(zhì)，如三七總皂苷、總黃酮、總酚及多糖，發(fā)揮著多種藥理作用，并且在一定的劑量下呈現(xiàn)較好的量-效關系，未表現(xiàn)出毒性。充分反映了中藥的多成分、多靶點和整體性治療特色[27]。但三七降脂的活性物質(zhì)基礎及其降脂作用尚待進一步闡明，尤其是可能存在的脂肪穩(wěn)態(tài)調(diào)控的作用機制尚待深入研究。