利用信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的組合篩選方法鑒定植物抗旱基因（2020.7.7 Plant Biotechnology Journal）

聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，到2030年，20%以上的發(fā)展中國(guó)家將面臨缺水問題。因此，農(nóng)作物改良的重要目標(biāo)之一是使作物具有耐旱性。植物水分利用效率（WUE）決定著植物應(yīng)對(duì)土壤中度或重度缺水的能力，是植物在干旱脅迫下生存的主要因素，也是保證產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。所以，提高植物水分利用率一直是作物抗旱育種中的主要目標(biāo)。

維管植物抗旱性和水分利用效率的機(jī)制十分復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，包括光合作用的光反應(yīng)、光合碳固定、植物激素和相關(guān)信號(hào)通路、氣孔功能等多種生理過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均參與其中。植物具有復(fù)雜的基礎(chǔ)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中各組分往往由大的基因家族編碼，所以還存在著功能冗余現(xiàn)象，這使得信號(hào)通路的研究充滿挑戰(zhàn)。近日，德國(guó)馬普所科研人員開發(fā)了一種基于綜合網(wǎng)絡(luò)選擇的方法來鑒定增強(qiáng)抗逆性的基因組合，并應(yīng)用此方法通過組合遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，篩選在干旱環(huán)境下存活的植株，并通過檢測(cè)生物量作為反映標(biāo)準(zhǔn)，成功篩選到了兩個(gè)鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）基因家族成員在植物抗旱中的作用，研究結(jié)果發(fā)表在知名植物學(xué)期刊Plant Biotechnology Journal上，題為《Improving plant drought tolerance and growth under water limitation through combinatorial engineering of signaling networks》。

鈣信號(hào)在真核生物中代表了一種古老的信號(hào)機(jī)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化的主要蛋白家族之一是鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs），該家族參與了包括長(zhǎng)期生長(zhǎng)發(fā)育過程以及對(duì)非生物和生物應(yīng)激刺激的短期快速信號(hào)反應(yīng)等生物過程。因?yàn)橹参锩{迫相關(guān)鈣信號(hào)的啟動(dòng)和傳播通常發(fā)生在質(zhì)膜上，所以作者選首先在擬南芥中篩選了15個(gè)位于質(zhì)膜CPKs，分別構(gòu)建了15個(gè)重組質(zhì)粒，另外構(gòu)建了用于卡那霉素轉(zhuǎn)基因株系篩選的含有nptII的重組質(zhì)粒，將16種質(zhì)粒混合并使用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化煙草。通過組合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和大規(guī)模篩選轉(zhuǎn)基因株系，共獲得450多株卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因株系，排除生長(zhǎng)發(fā)育異常、低育性的株系后，103個(gè)株系被用來收獲的T1種子用于隨后的篩選。在干旱處理后分別在23天和7天統(tǒng)計(jì)存活率，篩選證實(shí)了其中9個(gè)株系的耐旱性。然后，作者檢測(cè)了9個(gè)株系中轉(zhuǎn)化的基因和基因組合：與ABA信號(hào)和氣孔關(guān)閉有關(guān)的CPK3和CPK30分別在四個(gè)株系中檢測(cè)到;與耐生物脅迫相關(guān)的CPK5也在四個(gè)株系中檢測(cè)到;而出現(xiàn)頻率最高的是CPK28和CPK29，兩個(gè)基因均出現(xiàn)了5次，且在4個(gè)株系中同時(shí)出現(xiàn)。在以往研究中，CPK28和CPK29均未涉及非生物脅迫反應(yīng)。

接下來，作者對(duì)這兩個(gè)基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。作者分別獲得了擬南芥和高生物量作物煙草的單獨(dú)超量表達(dá)CPK28和CPK29的株系和同時(shí)超量表達(dá)CPK28/29的株系，通過耐旱性實(shí)驗(yàn)、滲透脅迫實(shí)驗(yàn)表明同時(shí)超量表達(dá)CPK28/29的株系存活率顯著提高，而過表達(dá)單基因的株系與野生型沒有顯著差異，這一結(jié)果清楚地證明了這兩個(gè)基因同時(shí)出現(xiàn)在篩選的抗旱性組合轉(zhuǎn)化群體中的功能意義。同時(shí)，N-28/29株系在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的發(fā)芽率和生長(zhǎng)量，表明CPK28和CPK29共表達(dá)的有益影響也可以擴(kuò)展到具有滲透機(jī)制的其他非生物脅迫。另外，作者證明了在適度水分限制條件下，N-28/29生物量積累比對(duì)照顯著增加，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的水分利用效率。而對(duì)適度水分虧缺的耐受性是一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，該結(jié)果表明了CPK28和CPK29在生產(chǎn)上的利用價(jià)值。最后，作者證明N-28/29植物對(duì)油菜甾體生物合成抑制劑BRZ的敏感性較低，表明這兩種鈣依賴性激酶的共表達(dá)刺激油菜素甾體信號(hào)，并通過這種方式提高水分限制條件下的耐旱性。

最后，為了證明該組合方法在分離復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和解剖大基因家族功能上的普遍適用性，作者又利用此方法成功篩選到了CPK基因家族中的CPK5對(duì)于鹽脅迫耐受的功能，并驗(yàn)證了CPK5的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照植株。該研究展示了一種高效的組合篩選、轉(zhuǎn)化的體系來鑒定復(fù)雜信號(hào)通路中的功能基因或基因組合，為功能基因的研究提供了新的方法和思路。