針刺對VD模型大鼠腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、NFK-βp65及PTEN mRNA表達(dá)水平的影響*

陳英華，王浩宇

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

血管性癡呆是指由于缺血性或出血性腦血管病，或者心臟和循環(huán)障礙引起的血流灌注所致的認(rèn)知功能障礙[1-3]。臨床表現(xiàn)有記憶力下降、認(rèn)知功能下降、定向力喪失、行為異常、日常社交及生活能力低下等, 是臨床常見的多發(fā)病。近年來，此病發(fā)病率呈上升趨勢, 大大提高了腦血管病患者的患病風(fēng)險及愈后康復(fù)治療，降低了患者的生存質(zhì)量, 給患者及家人帶來了痛苦和負(fù)擔(dān)。關(guān)于血管性癡呆的中醫(yī)藥治療取得了一定的成就。經(jīng)大量科學(xué)研究和臨床觀察證實，傳統(tǒng)針刺能夠明顯改善癡呆患者的記憶能力和提高患者的生活質(zhì)量[4]。本次實驗采用四血管阻斷法制作VD大鼠模型后，選取左右神聰穴、風(fēng)池穴進(jìn)行針刺，觀察VD大鼠的記憶能力，檢測大鼠腦組織中引起細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、NFK-βp65及PTEN mRNA表達(dá)的變化，論證針刺對于防治VD的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 選用168只健康SD大鼠，動物于安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)7天。將大鼠進(jìn)行Morris水迷宮初篩，以測試大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)與記憶的獲取能力。連續(xù)5天后，于第6天對大鼠的行為學(xué)進(jìn)行檢測，篩選出符合實驗條件的大鼠模型。結(jié)果顯示，實驗對象全部合格。

1.1.2 儀器 2135型組織切片機(jī)(德國萊卡)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic)；Motic Med6.0病理圖像分析系統(tǒng)(美國Motic); 電熱恒溫箱(上海一恒)；醫(yī)用微波爐(日本松下)。

1.1.3 試劑 兔抗caspase-3多克隆抗體(武漢博士德)；兔抗NFK-βp65多克隆抗體(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 VD模型建立 模型采用國際公認(rèn)的Pulsinelli四血管阻斷法制作[5]。大鼠術(shù)前禁水、食。麻醉大鼠，固定，取頸部正中切口, 分離雙側(cè)椎動脈，用電凝針燒灼使之形成永久性閉塞，注射適量青霉素于手術(shù)部位以抗感染。24 h后取腹部正中切口, 分離雙側(cè)頸總動脈, 用4號絲線穿線，牽拉頸總動脈但不影響頸動脈血流，使用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min共3次，1 h 1次。術(shù)后注射適量青霉素于施術(shù)部位，縫合，飼養(yǎng)觀察，連續(xù)7天給每只大鼠肌肉注射青霉素80 000 U以對抗感染。

1.2.2 實驗方法 在樣本中隨機(jī)篩選出兩組大鼠各24只分為正常組、假手術(shù)組，將剩余備用的120只大鼠制作VD模型。將造模成功的72只大鼠隨機(jī)分為3組(模型組、手針組、電針組)，各24只，在造模后的第7天、第14天及第21天對5組大鼠進(jìn)行觀察、測試，每次挑選8只觀察。

正常組：不予任何處置。

假手術(shù)組：手術(shù)過程同VD模型制作方法，但不電凝雙側(cè)椎動脈，不阻斷雙側(cè)頸總動脈。

模型組：只造模。

手針組：選取左右神聰穴、風(fēng)池穴參照李忠仁主編《實驗針灸學(xué)》[6]。操作方法：造模7天后，用0.30 mm×40 mm毫針針刺左右神聰穴，平刺2.5 mm,雙側(cè)風(fēng)池穴，斜刺5 mm，捻轉(zhuǎn)1 min，休息1 min，再捻轉(zhuǎn)1 min，再休息1 min，再捻轉(zhuǎn)1 min，留針，治療每次30 min，日1次。在治療的第7天、14天、21天分別對大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試以及各觀察指標(biāo)測試。

電針組：于造模成功后第7天開始針刺，選取左右神聰穴、風(fēng)池穴。具體方法同手針組，然后連接長城牌KWD-808Ⅰ型脈沖電療儀于同側(cè)穴位，選取連續(xù)波，設(shè)定電壓2 V，頻率為2 Hz，電流100 μA，以大鼠肢體微顫為度。每次留針30 min，日1次。

1.2.3 大鼠行為學(xué)檢測 實驗采用Morris水迷宮測試大鼠的行為學(xué)習(xí)、記憶能力。水迷宮測試包括定位航行實驗、空間搜索實驗。通過記錄大鼠尋找并爬上水下平臺所需要的時間來檢驗大鼠的學(xué)習(xí)能力。通過記錄大鼠在規(guī)定時間內(nèi)穿過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)來進(jìn)行空間搜索實驗可檢測大鼠平臺空間位置的記憶能力。記錄造模前、造模后14天實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。

1.2.4 大鼠海馬區(qū)Caspase-3、NFK-βp65陽性蛋白數(shù) 于針刺治療的第7天、第14天、第21天的時間點進(jìn)行水迷宮測試完畢后，采集標(biāo)本，用4%多聚甲醛PBS200 mL灌注固定，取腦，分離海馬稱重，分別標(biāo)記。采用PV兩步法，嚴(yán)格按照說明書操作。海馬內(nèi)的Caspase-3、NFK-βp65陽性蛋白表達(dá)呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。采用Motic Med6.0病理圖像分析系統(tǒng)，每組選取8例分析并計算陽性細(xì)胞總數(shù)，取平均值。

1.2.5 大鼠海馬區(qū)PTEN mRNA檢測 RT-PCR測定PTEN mRNA的表達(dá)取大鼠海馬區(qū)100 mg，應(yīng) 用RNA提取試劑盒提取得總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物并進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR，引物的序列分別為：PTEN mRNA擴(kuò)增引物：上游5′gCgAgCTgTTTTTCCACCTCT 3，下游5′TgATgTCgCggTACACCACAT 3′；β-actin擴(kuò)增引物：上游5′CAACCgTgAAAAgATgACCCA 3，下游5′AATgCCAgTggTACgACCAgA 3。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果分析

2.1.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 由表1可知，造模前各組大鼠逃避潛伏期無明顯差異，比較結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后14天模型組、手針組、電針組大鼠與造模前各組對比逃避潛伏期明顯延長，差異極顯著(P<0.01);造模后14天，手針組、電針組與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 空間探索試驗比較 由表2可知，造模前，各組大鼠成功穿越平臺次數(shù)無明顯差異，結(jié)果不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后14天模型組、手針組、電針組大鼠成功穿越平臺次數(shù)與造模前相比明顯減少，差異極顯著(P<0.01)。顯示造模成功。與模型組比較，手針組大鼠成功穿越平臺次數(shù)明顯升高(P<0.05);電針組更為明顯(P<0.01)。

表1 造模前、造模后14 d各組大鼠逃避潛伏期的比較

注：與造模前比較，**P<0.01;與模型組比較，▲P<0.05。

表2 造模前、造模后14 d各組大鼠穿越平臺次數(shù)的比較次)

注：與造模前比較，**P<0.01;與模型組比較，▲P<0.05,△△P<0.01。

2.2 治療前后各組大鼠海馬區(qū)caspase-3、NFK-βp65陽性細(xì)胞數(shù)的變化

由表3可知，正常組和假手術(shù)組海馬區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)較少于其他3組，模型組海馬區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)較多。在3個不同時間點，手針組、電針組的大鼠海馬區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)相比同一時刻的模型組陽性細(xì)胞數(shù)有所下降，說明針刺治療(手針、電針)均能降低caspase-3的陽性表達(dá)。見封三彩圖1。

由表4可知，正常組、假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)均可見少量NFK-βp65細(xì)胞。模型組NFK-βp65細(xì)胞陽性表達(dá)較多，且在3個時間點內(nèi)測得的陽性細(xì)胞表達(dá)呈遞增趨勢。在3個時間點上，手針組、電針組大鼠的NFK-βp65陽性表達(dá)與同時刻模型組相比較有所下降，具有顯著性差異，說明針刺可以降低VD大鼠海馬區(qū)的NFK-βp65陽性表達(dá)。見封三彩圖2。

2.3 RT-PCR檢測大鼠海馬區(qū)PTEN mRNA結(jié)果

由表5可知，治療后各個時間點大鼠海馬區(qū)均有PTEN mRNA表達(dá)，正常組和假手術(shù)組PTEN mRNA表達(dá)較弱；治療后各組同一時間點，與正常組比較，模型組、手針組、電針組的PTEN mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)。治療后各同一時間點，手針組、電針組的PTEN mRNA表達(dá)水平較模型組低，均有顯著性差異(P<0.01)，且電針組較顯著。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織中PTEN mRNA表達(dá)

組別n治療第7 d治療第14 d治療第21 d正常組819.88±3.2719.88±3.2719.88±3.27假手術(shù)組822.00±2.2421.00±5.0922.38±3.81模型組835.13±1.73**★★40.38±4.50**★★45.00±5.90**★★手針組829.63±3.38**★★▲▲31.75±3.28**★★▲▲29.75±3.33**★★▲▲電針組831.38±2.19**★★▲33.88±2.42**★★▲▲31.13±3.31**★★▲▲

注：與正常組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與假手術(shù)組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表4 各組大鼠海馬區(qū)NFK-βp65陽性細(xì)胞數(shù)比較

注：與正常組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與假手術(shù)組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表5 各組大鼠海馬組織中PTEN mRNA相對表達(dá)量比較

注：與正常組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與假手術(shù)組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 討論

Morris水迷宮實驗是由Morris本人于1981年建立的，通過強(qiáng)迫實驗動物游泳并學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的方法來測試實驗對象對空間位置覺和方向覺的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實驗主要包括定位航行實驗、空間探索實驗等。實驗系統(tǒng)由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng)組成[7]。本次實驗運用Morris水迷宮對大鼠在造模前、造模后進(jìn)行行為學(xué)測試，檢測結(jié)果直觀、明顯。

VD動物模型的制作，是研究發(fā)病機(jī)制、治療藥物等的重要條件，其中較為常見的方法為血管阻斷法[8-9]，其中包括兩血管阻斷法、三血管阻斷法、四血管阻斷法、雙側(cè)頸總動脈狹窄法、單側(cè)頸總動脈閉塞法、大腦中動脈阻斷法、血管栓塞法。本次實驗采用四血管阻斷法制作VD模型大鼠[10]，可高度模仿VD發(fā)病特點，病理改變充分，無明顯肢體活動障礙，且在不斷被改進(jìn)完善中。

血管性癡呆屬中醫(yī)“呆病”“癲癡”等范疇[11]，明代張介賓《景岳全書·雜病謨》首先提出了癡呆的病名、病因病機(jī)、臨床表現(xiàn)、預(yù)后和治法，云：“癡呆證，凡平素?zé)o痰而或以郁結(jié)，或善愁，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐，而漸致癡呆，言辭顛倒，舉動不驚，或多汗，或善愁，其證則千奇百怪，無所不至?！泵鞔顣r珍《本草綱目·辛夷》提出：“腦為元神之府?！鼻宕跚迦巍夺t(yī)林改錯·腦髓說》明確指出：“靈機(jī)記性，不在心在腦”。故本病病變部位在腦，與心肝脾腎功能失調(diào)密切相關(guān)。為本虛標(biāo)實之病，臨床上多見虛實夾雜之證，臟腑之精血清氣上注于腦，腦竅蒙蔽則心神不穩(wěn)，發(fā)為癡呆。故血管性癡呆的治療重點應(yīng)該在腦，而歷代醫(yī)家亦有“病變在腦, 首取督脈”之說。督脈行于脊里，總督人體一身之陽，其“上額交巔, 入絡(luò)腦”，且督脈源于胞中, 出會陰而絡(luò)于腎, 腎藏精生髓, 髓充腦,寧則神安。故腦竅清明、神志調(diào)和與督脈條暢與否密切相關(guān)[12]。中醫(yī)治療癡呆以補(bǔ)虛為主，同時根據(jù)痰、瘀、火、毒輕重分別兼以化痰、祛瘀、清火、解毒等。癡呆的預(yù)防首先是針對癡呆的危險人群，在無癥狀期采取必要措施干預(yù)癡呆的危險因素，清淡飲食、快步行走等具有延緩或預(yù)防癡呆的作用。其次是針對癡呆的前驅(qū)期人群，在患者輕度認(rèn)知損害階段，積極治療并跟蹤隨訪，對延緩其發(fā)展為癡呆具有重要意義。

現(xiàn)代研究證明，針灸對于治療VD具有顯著療效。針灸可以明顯改善VD患者的臨床癥狀，改變其血流動力學(xué)、血液流變學(xué)，改善患者的腦部功能，改善癡呆癥狀，提高智力，增強(qiáng)社會活動能力。

四神聰穴，經(jīng)外奇穴，位于頭頂部，當(dāng)百會穴前后、左右各1寸，共4穴。據(jù)歷代文獻(xiàn)記載，其主治有頭痛、癡呆、眩暈、癲癇等癥[13]。王清任認(rèn)為“腦為元神之府，靈機(jī)記憶在腦不在心”“多年無記憶者，腦髓漸空”。風(fēng)池穴出自《靈樞·熱病》, 另名熱府, 屬足少陽膽經(jīng), 為手、足少陽、陽維之會。巔頂之上, 惟風(fēng)可到, 風(fēng)池穴位居頭項, 形象如池, 是風(fēng)邪易于留戀和治療風(fēng)邪當(dāng)取之處, 故風(fēng)池以此得名，該穴具有熄風(fēng)潛陽、疏風(fēng)解表、清腦安神、聰耳明目、舒筋通絡(luò)之功效[14]。膽主少陽, 為開合之樞機(jī), 可外開太陽, 內(nèi)合陽明。風(fēng)池位于膽經(jīng), 可調(diào)暢氣機(jī), 升清降濁, 由里及表, 只要涉及膽經(jīng)經(jīng)脈循行部位及臟腑氣機(jī)不利, 并出現(xiàn)相關(guān)病變, 即可應(yīng)用風(fēng)池穴進(jìn)行治療[14]。從現(xiàn)代解剖位置而言, 頭部穴位周圍分布有豐富的血管和神經(jīng), 其中包括左右顳淺動脈、左右顳淺靜脈及枕動、靜脈吻合網(wǎng)等。故取四神聰穴、風(fēng)池穴行針刺，以開竅醒腦、提神益智、養(yǎng)心安神，改善腦部血液循環(huán)，改善腦神經(jīng)細(xì)胞的電生理活動，從而提高腦的功能，改善癡呆癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。

實驗將傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論有機(jī)結(jié)合，根據(jù)導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗指導(dǎo)下完成，通過針刺四神聰穴、風(fēng)池穴治療VD。通過實驗發(fā)現(xiàn),造模成功后VD大鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，Caspase-3、NFK-βp65在VD大鼠大腦海馬中的陽性表達(dá)較正常組明顯增高。通過對VD大鼠進(jìn)行針刺治療后可以觀察到VD大鼠逃避潛伏期明顯縮短、成功穿越平臺次數(shù)顯著增多，Caspase-3、NFK-βp65的陽性表達(dá)及PTEN mRNA表達(dá)水平均有所降低。說明針刺對于改善VD的臨床癥狀有顯著效果。

總之，對VD大鼠進(jìn)行頭針針刺后，VD大鼠水迷宮逃避潛伏期明顯縮短、成功穿越水迷宮平臺次數(shù)增多，改善VD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，并有效降低VD大鼠海馬Caspase-3、NFK-βp65細(xì)胞的陽性表達(dá)數(shù)及PTEN mRNA表達(dá)水平，且據(jù)觀察，電針組的治療效果更為突出，為中醫(yī)臨床針刺治療 VD 提供一定的理論和實驗依據(jù)。