貪銅桿菌Cupriavidus sp. SHE細胞上清液合成納米硒

楊穎，厲舒禎，范書伶，楊婧，李政，張珩琳，曲媛媛

大連理工大學 環(huán)境學院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024

目前，關(guān)于納米硒在抗癌、抗氧化、抗菌等醫(yī)學方面的相關(guān)應用已有不少報道。對于納米硒的合成而言，生物法因成本低廉、無毒、環(huán)保等特點，引起了人們的廣泛關(guān)注[1]。在合成納米硒的眾多生物資源中，細菌是一種高效的綠色納米合成工廠，大量文獻報道不同種類的細菌能夠合成尺寸與形態(tài)各異的納米硒顆粒。例如，生枝動膠菌Zooglea ramigera和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis均可在體外合成尺寸均一、分散性良好的球形納米硒顆粒[2-3]。貪酮桿菌Cupriavidus metalliduransCH34可在細胞內(nèi)將亞硒酸鹽還原為單質(zhì)納米硒，且其胞內(nèi)含有大量重金屬抗性基因[4]。然而，目前關(guān)于菌株胞外合成納米硒的研究仍未見報道。與胞內(nèi)合成納米硒相比，胞外合成反應步驟簡單、不需要繁瑣的后續(xù)操作，如細胞破碎以及溶劑萃取分離產(chǎn)物等，具有更廣泛的應用前景[5]。

此外，關(guān)于納米硒在生物醫(yī)學等方面的應用也有很多。Khiralla等研究發(fā)現(xiàn)用菌株嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaSeITE02合成的納米硒顆粒對大腸桿菌具有良好的抗菌活性，也有文獻表明該菌株無法合成具有良好抗菌活性的納米硒顆粒，但其合成的納米硒顆粒生物相容性較好[6-7]。通常納米硒顆粒的形貌不同對其性質(zhì)會產(chǎn)生一定的影響。Urarika等通過分子設(shè)計和合成的方式成功合成出尺寸為300 nm的立方體結(jié)構(gòu)的單質(zhì)納米硒顆粒，且通過實驗證明該種形貌的納米硒相較于球形顆粒而言對乳腺癌細胞具有更強的抗癌能力[8]。而迄今為止，如何利用生物法定向合成特定形貌或尺寸的納米硒顆粒仍是目前的研究難點，有待于進一步的研究發(fā)現(xiàn)。

本研究選擇前期篩選的貪銅桿菌Cupriavidussp. SHE，分別探究其細胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細胞合成納米硒的能力，并對細胞上清液合成的生物納米硒顆粒進行形貌及尺寸表征分析。通過考察生物轉(zhuǎn)化合成納米硒過程中的關(guān)鍵蛋白，對生物納米硒的合成機理進行初步探索。最后利用大腸桿菌Escherichia coliBL21和假單胞菌Pseudomonassp. PI1考察合成的納米硒顆粒的抗菌特性。

1 材料與方法

1.1 菌株

貪銅桿菌Cupriavidussp. SHE分離自大連理工大學牛角山泥土樣品，現(xiàn)已鑒定并保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC No.9266菌株Cupriavidussp. SHE的16S rRNA基因序列儲存于 GenBank數(shù)據(jù)庫，保存號為KJ875863。菌株Cupriavidussp. SHE采用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分為：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L[9]。

1.2 主要試劑

二氧化硒 (SeO2)，購自天津市化學試劑研究所；氯化鈉 (NaCl)，購自天津市富宇精細化工有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；菌株Escherichia coliBL21為實驗室購買的工程菌，菌株P(guān)seudomonassp.PI1為實驗室前期分離篩選得到。本實驗所用試劑均為分析純及以上。

1.3 利用菌株Cupriavidus sp. SHE細胞上清液、全細胞和胞內(nèi)提取物合成納米硒

從土壤中分離的菌株Cupriavidussp. SHE于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為150 r/min、30 ℃、24 h。菌株達到對數(shù)生長期后，菌液在10 000 r/min下離心10 min (Avanti-30型，美國E Beckman公司)[8]，用注射器將離心后的上清液透過 0.45 μm的濾膜進行過濾，得到細胞上清液。離心后的菌細胞用超純水沖洗3次，再利用超純水將其OD600調(diào)整為 1.0得到菌株的全細胞溶液。將離心后得到的菌細胞用超純水清洗3次后用一定量的超純水重懸，然后利用超聲破碎儀 (超聲波處理器CPX 750、美國) 破碎30 min，將破碎后的體系在10 000 r/min條件下離心10 min，離心后得到的上清液用 0.45 μm 濾膜進行過濾，得到菌株Cupriavidussp. SHE的胞內(nèi)提取液。最后將上述3種反應體系分別與 5 mmol/L SeO2在 30 ℃、150 r/min條件下反應，合成納米硒顆粒。

1.4 納米硒的表征

首先通過溶液顏色變化直接觀察納米硒的生成，然后在400–800 nm波長范圍內(nèi)用紫外分光光度計 (UV-vis，Metash UV-9000，中國) 對反應體系進行測量，考察其納米硒的合成情況。用透射電子顯微鏡 (TEM，F(xiàn)EI Tecnai G2 Spirit，荷蘭)對菌株Cupriavidussp. SHE的細胞上清液合成的納米硒顆粒的大小及形貌進行表征分析，用X射線衍射 (XRD，Rigaku，日本) 對菌株Cupriavidussp. SHE的細胞上清液合成的納米硒晶體結(jié)構(gòu)進行表征分析，用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜 (FTIR，IRPrestige-21，Japan) 在 400–4 000 cm–1范圍內(nèi)對反應體系中可能參與納米硒生物合成的物質(zhì)的官能團進行表征分析。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分析生物合成的納米硒

為了研究可能參與納米硒還原和穩(wěn)定的蛋白，采用 SDS-PAGE進行分析[10]。將菌株Cupriavidussp. SHE在10 000 r/min下離心30 min，收集合成的含有結(jié)合蛋白的納米硒，然后用超純水洗滌 3次，再懸浮于超純水中，最后利用SDS-PAGE對納米硒表面附著的蛋白進行分析。

1.6 納米硒的抗菌活性

本實驗采用紙片擴散法對納米硒的抗菌活性進行初步的考察，實驗選取革蘭氏陽性菌Pseudomonassp. PI1和革蘭氏陰性菌E. coliBL21進行抗菌實驗。首先在瓊脂平板 (MHA) 上分別接種上述兩種菌液 200 μL (1.5×108CFU/mL)，用無菌棒涂勻。將濾紙剪成直徑為10 mm的圓盤狀，取25 μL納米硒滴在剪好的濾紙上，然后用無菌鉗把濾紙放在瓊脂板上，以滅菌超純水為對照。37 ℃培養(yǎng)24 h后，通過觀察在紙片周圍是否存在抑菌圈以及抑菌圈直徑的大小來判斷納米硒顆粒對兩株常見致病菌的抗菌性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Cupriavidus sp. SHE合成納米硒的能力

本實驗利用菌株Cupriavidussp. SHE的細胞上清液、胞內(nèi)提取物和全細胞3個反應體系分別與SeO2作用，合成納米硒顆粒。反應數(shù)天后，3個反應體系中均可觀察到體系顏色從無色逐漸變?yōu)槌燃t色，細胞上清液和胞內(nèi)提取物體系在7 d內(nèi)達到穩(wěn)定，全細胞體系在10 d內(nèi)達到穩(wěn)定。使用UV-vis分析表明，如圖1所示，3個反應體系在600 nm處出現(xiàn)了明顯的特征吸收峰，證明反應體系中有納米硒的生成[11]。用Bradford試劑盒測試蛋白質(zhì)濃度顯示，細胞上清液中的蛋白濃度(25 mg/L) 遠低于胞內(nèi)提取物 (150 mg/L)，但實驗現(xiàn)象卻表明細胞上清液具有更強的納米硒合成能力[12]。因此，推測菌株Cupriavidussp. SHE能分泌某些生物活性分子，例如谷胱甘肽 (glutathione，GSH) 等，能在胞外作為還原劑還原Se (IV) 為單質(zhì)納米硒顆粒[10]。有研究表明，α、β和γ變形菌門的菌株能夠在胞外分泌較高濃度的谷胱甘肽參與亞硒酸的還原和納米硒的生成[13]。在本實驗中，菌株Cupriavidussp. SHE屬于β變形菌門，在細胞上清液中可能存在大量的谷胱甘肽類物質(zhì)，因此我們可以在未來實驗中進行進一步的考察研究。

圖1 不同反應體系下菌株Cupriavidus sp. SHE (A)全細胞、(B) 胞內(nèi)提取物以及 (C) 細胞上清液合成納米硒的UV-vis光譜圖Fig. 1 UV-vis spectra of SeNPs synthesized by (A) the cells, (B) cell extracts and (C) cell-free supernatant of strain SHE. The insets show the color of SeNPs before and after reaction. Reaction condition: pH 7, 5 mmol/L SeO2.

隨后考察不同SeO2濃度及不同溶液pH對菌株Cupriavidussp. SHE細胞上清液合成納米硒的影響。SeO2濃度對生物合成納米硒的影響如圖2A所示。當SeO2濃度在1–5 mmol/L時，隨著SeO2濃度的增大，其在UV-vis圖中的特征吸收峰峰值逐漸增加，但當SeO2濃度進一步增大至7 mmol/L及以上時，其特征吸收峰峰值明顯下降。相關(guān)文獻表明反應體系中納米硒的濃度與其在UV-vis中的特征吸收峰峰值呈正相關(guān)關(guān)系[12]，因此菌株Cupriavidussp. SHE的細胞上清液合成納米硒的最佳SeO2濃度為5 mmol/L。由于反應體系pH值的不同會影響到細胞提取物中酶的活性，進而會對納米硒的合成造成一定的影響，因此本實驗設(shè)置了6個不同的pH梯度，分別考察了細胞上清液在酸性、中性以及堿性條件下合成納米硒的情況。其UV-vis結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，當反應體系pH值為5和10時，UV-vis圖中沒有出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，表明此時反應體系中沒有納米硒的產(chǎn)生，當反應體系pH為7時，其特征吸收峰值達到最大，因此，pH為7是菌株Cupriavidussp.SHE上清液合成納米硒的最佳條件。

2.2 生物合成納米硒的表征

我們采用TEM觀察菌株Cupriavidussp. SHE上清液合成的納米硒顆粒的形貌和尺寸分布，如圖3所示。生物合成的納米硒顆粒主要為球形，少數(shù)為棒狀，且具有良好的分散性。進一步利用粒徑分析軟件Nano Measurer 1.2對合成的納米硒顆粒粒徑進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的納米硒尺寸粒徑分布在83–480 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為196 nm。有研究表明菌株嗜堿假單胞菌Pseudomonas alcaliphila和菌株Zooglea ramigera合成的納米硒顆粒的形貌在一定環(huán)境因素作用下會發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為棒狀顆粒[2]。推測可能是因為大尺寸球形納米硒顆粒的自由能遠高于三角形或棒狀納米硒顆粒而導致自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所以球形納米硒顆粒在反應體系中能自發(fā)溶解形成小尺寸的硒原子，而較小尺寸的硒原子可再次組裝形成一定尺寸的棒狀納米硒顆粒，降低了自身的自由能提高了穩(wěn)定性[2]。

圖2 不同SeO2濃度 (A) 以及pH (B) 條件下菌株Cupriavidus sp. SHE細胞上清液合成納米硒的UV-vis圖Fig. 2 Uv-vis diagram of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE SHE with cell supernatant under different SeO2 concentration (A) and pH (B) conditions.

圖3 菌株Cupriavidus sp. SHE細胞上清液合成納米硒的TEM圖Fig. 3 TEM images of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE with cell supernatant. (A) Spherical SeNPs. (B)Rod-like SeNPs. (C) Size distribution diagram.

對合成的納米硒顆粒進行XRD表征分析，結(jié)果如圖 4所示。與納米硒顆粒的六方型標準卡(JCPDS No. 06-0362) 對比可知，2θ在 23.74o、30.50o、42.16o、44.32o、46.81o、52.84o以及 62.30o處出現(xiàn)7個明顯的衍射峰，分別與六方晶型結(jié)構(gòu)的 (100)、(101)、(110)、(102)、(111)、(201)、(202)晶面相對應[9]，并且 (101) 面的衍射峰強度明顯高于其他峰，由此可說明合成的納米硒晶體顆粒以 (101) 面為主導。

圖4 菌株Cupriavidus sp. SHE細胞上清液合成納米硒的XRD圖Fig. 4 XRD image of SeNPs synthesized by Cupriavidus sp. SHE.

圖5 菌株Cupriavidus sp. SHE細胞上清液及其合成的納米硒的FTIR圖Fig. 5 FTIR image of the cell-free supernatant of strain SHE and the biogenic SeNPs.

為了對生物合成納米硒的機制進行初步的探索，我們對合成的納米硒顆粒進行FTIR表征分析，結(jié)果如圖5所示。其中，3 430、1 454和1 050 cm-1處的特征吸收峰分別對應-N-H、-COO和C-N的拉伸振動峰，1 652、1 542和1 245 cm-1處的特征吸收峰對應氨基I、II和III的特征吸收峰[14-15]，表明一些蛋白質(zhì)可能參與了納米硒的合成或穩(wěn)定過程。例如，有研究表明陶厄式菌Thauera selenatis能在胞外分泌一種蛋白Sefa，該蛋白是一種良好的封端劑，能有效防止合成的納米硒顆粒相互聚集[16]。同樣地，用生枝動膠菌Z. ramigera和大腸桿菌E. coli合成的納米硒顆粒表面也可能存在著一些蛋白類物質(zhì)，對納米硒的合成和穩(wěn)定過程起著重要的作用[2,17]。綜上，我們推測在生物合成的納米硒表面通常會覆蓋一層蛋白類物質(zhì)，它們的存在能促進納米硒的還原也防止了小尺寸納米硒顆粒的聚集，從而使合成的納米硒顆粒尺寸更為均一，分散性更為良好。

SDS-PAGE分析表明 (圖 6)，在凝膠上出現(xiàn)多條不同大小分子量的條帶，且隨著樣品體積量的增加，條帶的顏色加深，由此可說明在合成的納米硒顆粒的表面附著了一層蛋白質(zhì)物質(zhì)。Malhotra等發(fā)現(xiàn)某些小分子蛋白可以較為容易地通過質(zhì)膜排到培養(yǎng)基上清液中，與金屬離子反應生成納米顆粒[18]。因此，我們推測在SDS-PAGE中分離的蛋白質(zhì)物質(zhì)也在納米硒的合成和穩(wěn)定過程中起到了重要的作用。

2.3 納米硒的抗菌活性

圖6 SeNPs表面蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of proteins bound to biosynthesized SeNPs. Lane M: standard protein molecular weight marker; lane 1: 5 μL bound proteins;lane 2: 10 μL bound proteins.

圖7 生物合成的納米硒對E. coli BL21 (A) 和Pseudomonas sp. PI1 (B) 的抗菌活性Fig. 7 The antimicrobial activities of biosynthesized SeNPs against E. coli BL21 (A) and Pseudomonas sp. PI1 (B).

最后，我們利用菌株P(guān)seudomonassp. PI1和E. coliBL21對本實驗中合成的納米硒顆粒的抗菌性進行考察，如圖7所示，當納米硒濃度為0.5–50 mg/mL時，平板中的小紙片周圍均未發(fā)現(xiàn)明顯的抑菌圈，由此可說明用菌株Cupriavidussp.SHE細胞上清液合成的納米硒顆粒生物相容性較好。已有研究證實，用嗜麥芽窄食單胞菌S. maltophiliaSeITE02和地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis的無細胞上清合成的納米硒顆粒對菌株E. coli具有較為明顯的抗菌活性[6,19]。然而，在考察菌株熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens和枝孢菌Cladosporiumsp. JAPSK3合成的納米硒顆粒的抗菌性時，得到的結(jié)果卻截然不同[7]。利用酸奶中的益生菌產(chǎn)生的納米硒已被證實是一種無毒、安全的食品添加劑[20]。目前有研究人員提出納米硒的抗菌性大小可能與納米硒的濃度以及顆粒大小有關(guān)，此外，納米硒顆粒的形貌以及其元素組成也會對其諸多物理化學性質(zhì)產(chǎn)生影響[6,19]。綜上，本研究利用菌株Cuprivadiussp. SHE細胞上清液獲得的納米硒無毒且生物相容性較好，因此該納米硒顆粒在生物醫(yī)學或食品工業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應用前景。

3 結(jié)論

本實驗探究了菌株Cupriavidussp. SHE細胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細胞合成納米硒的能力，對其合成納米硒顆粒的形貌進行表征，并通過分析納米硒表面關(guān)鍵蛋白初探合成機理，最后對生物合成納米硒的抗菌特性進行考察，實驗結(jié)論如下：(1) 在利用菌株Cupriavidussp. SHE的細胞上清液、胞內(nèi)提取物以及全細胞進行納米硒合成過程中，通過UV-vis均發(fā)現(xiàn)在600 nm處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，表明3個反應體系均具有生物合成納米硒的能力。(2) 菌株Cupriavidussp. SHE細胞上清液合成的納米硒的形貌主要為球形，少數(shù)為棒狀，且顆粒分散性良好，平均粒徑為196 nm；XRD分析表明合成的納米硒顆粒的晶體結(jié)構(gòu)為六方形結(jié)構(gòu)，并且以 (101) 面為主導。(3) 本實驗利用FTIR和SDS-PAGE表征對納米硒生物合成的機理進行了初步分析，結(jié)果表明覆蓋在納米硒顆粒表面的某些小分子蛋白可能參與了納米硒的合成及穩(wěn)定過程，在后續(xù)實驗中將引進基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白組等組學技術(shù)對該過程中具體的分子機制或其中起關(guān)鍵作用的蛋白進行進一步的揭示。(4) 本實驗表明菌株Cupriavidussp.SHE細胞上清液胞外合成的納米硒顆粒對E. coliBL21和Pseudomonassp. PI1均無抗菌活性，說明菌株Cupriavidussp.SHE合成的納米硒顆粒無毒且生物相容性好。