鯊源單域抗體的研究進(jìn)展

劉星，陳奇

海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228

自Kohler和Milstein[1]發(fā)明雜交瘤技術(shù)以來，理化性狀均一、生物活性單一的單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于免疫檢測、醫(yī)學(xué)診斷以及疾病治療等領(lǐng)域。其中，首個抗體藥物抗CD3抗體 (OKT3) 于1986年通過美國 FDA的審查，隨后，由于靶向性好、副作用小等優(yōu)點，抗體藥物逐漸成為生物制藥行業(yè)發(fā)展最快的種類之一。到2018年底，據(jù)不完全統(tǒng)計已有69種抗體藥物通過FDA批準(zhǔn)上市[2-3]。據(jù)Grilo及Mantalaris統(tǒng)計，2017年抗體藥物的市場銷售額為980億美元，預(yù)計到2022年銷售額將達(dá)到1 370億至2 000億美元，領(lǐng)跑所有的生物類藥物[3]。

回顧整個抗體應(yīng)用 (藥物及免疫試劑) 的發(fā)展歷程，可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)抗體的固有屬性一直是制約其發(fā)展的關(guān)鍵因素。首先傳統(tǒng)抗體尺寸大，難以穿越腫瘤組織以及人體屏障，限制了抗體藥物的應(yīng)用范圍。其次，傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其作為免疫試劑時易失效，從而限制了相關(guān)抗體試劑的應(yīng)用領(lǐng)域。為了克服上述問題，通過基因工程技術(shù)對傳統(tǒng)抗體進(jìn)行了多種形式的小型化改造，先后開發(fā)出了抗體可變區(qū)片段(Antigen-binding fragment，F(xiàn)ab)、單鏈抗體(Single-chain variable fragment，ScFv) 等小分子抗體，然而這些小分子抗體往往表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性以及親和力[4-5]。

1993年天然缺失輕鏈的重鏈抗體 (Heavychain antibodies，HcAbs) 首先在駱駝科動物中被發(fā)現(xiàn)[6]。隨后，1995年，在護(hù)士鯊Ginglymostoma cirratum體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有類似重鏈抗體結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白，被稱為IgNAR[7]。HcAbs及IgNAR的發(fā)現(xiàn)為抗體小型化研究提供了新的發(fā)展方向，并引發(fā)了對單域抗體 (VHH及 VNAR) 的研究熱潮。單域抗體所固有的分子量小、親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、溶解度好、組織穿透性強(qiáng)以及可識別隱藏抗原表位等優(yōu)點使其在免疫檢測[8]、醫(yī)學(xué)成像[9]、體外診斷[10-11]以及疾病治療[12-13]等領(lǐng)域中受到廣泛的關(guān)注。由于駱駝科動物的飼養(yǎng)較鯊魚更為容易等原因，早期對單域抗體的研究主要集中于駱駝科動物。目前國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)綜述了VHH的結(jié)構(gòu)及功能特性及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來針對鯊源單域抗體的研究日益增多，對其結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識不斷加深，應(yīng)用也日漸廣泛。但是，目前國內(nèi)未見關(guān)于鯊源單域抗體的綜述報道。因此，文中詳細(xì)綜述了鯊源單域抗體的結(jié)構(gòu)及功能特性、制備及人源化改造技術(shù)、親和力成熟策略以及應(yīng)用領(lǐng)域，并系統(tǒng)性分析了鯊源單域抗體的優(yōu)缺點，最后對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 IgNAR的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì) 60年代首次證明，鯊魚能夠?qū)乖碳ぎa(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[14]，表明其存在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。首先在鯊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白為IgM，其具有2種不同沉降系數(shù) (19S及7S) 的類型。其中，7S型IgM的親和力經(jīng)免疫后會提高，并且存在記憶效應(yīng)[15-16]。第2種被發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白為IgW，其與高等脊椎動物IgD同源性較高。分泌型IgW存在2種類型，分別包括3個和7個結(jié)構(gòu)域[17]。

1995年，Andrew等在護(hù)士鯊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同于IgM和IgW的新型免疫球蛋白IgNAR，其最初被發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞抗原受體 (T cell receptor，TCR)同源性較高，從而被命名為新抗原受體(New antigen receptor，NAR)[7]，但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該分子與免疫球蛋白存在諸多類似的結(jié)構(gòu)及功能特性，因此被重新命名為IgNAR[18]，IgNAR與傳統(tǒng)抗體不同，它是由2條重鏈組成的同源二聚體，缺乏輕鏈 (圖1)。與經(jīng)典的B細(xì)胞受體一樣，IgNAR以分泌型和膜結(jié)合型的形式存在，由被稱為 VNAR的可變區(qū)和不同數(shù)量的恒定區(qū)組成。其中，分泌型IgNAR具有5個恒定區(qū)[19]。IgNAR在適應(yīng)性免疫中的作用由Dooley等首次證實，其以雞卵清溶菌酶 (HEL) 為抗原免疫護(hù)士鯊，經(jīng)過長達(dá)3年的監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)在多次間隔免疫之后，護(hù)士鯊產(chǎn)生了快速且顯著增強(qiáng)的IgNAR免疫應(yīng)答反應(yīng)[20]。

2 IgNAR的起源及進(jìn)化

軟骨魚綱 (Chondrichthyes) 是與哺乳動物在進(jìn)化上距離最遠(yuǎn)的具有真正適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的脊椎動物，由全頭亞綱 (Holocephali) 和板鰓亞綱(Elasmobranchii) 組成[21]。其中板鰓亞綱可分為鯊總目 (Selachimorpha) 和鰩總目 (Batoidea)[22]。

圖1 不同類型抗體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of different types of antibodies.

2006年 Criscitiello等在護(hù)士鯊等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NAR-TCR的存在[23]。最初認(rèn)為，NAR-TCR是IgNAR基因簇和 TCR位點基因重組的產(chǎn)物。但是，2007年Venkatesh等對全頭亞綱魚類象鼻鯊Callorhinchus milii的全基因組數(shù)據(jù)分析，只發(fā)現(xiàn)了NAR-TCR的存在，而沒有找到IgNAR存在的證據(jù)[24-25]，表明NAR-TCR的出現(xiàn)早于IgNAR，因此推測IgNAR的可變區(qū)可能源于NAR-TCR。同時由于IgNAR中最后4個恒定區(qū)與IgW的恒定區(qū)同源性較高，因此有學(xué)者認(rèn)為在 2.2億年前軟骨魚綱分化為全頭亞綱和板鰓亞綱前后，NAR-TCR與IgW發(fā)生基因重組，并丟失CH1，導(dǎo)致在板鰓亞綱魚類 (鯊、鰩) 中出現(xiàn)了IgNAR[23,26-27]，因此基于IgNAR所開發(fā)的VNAR包括鰩源及鯊源2種。至于VNAR的起源，到目前為止依然沒有定論，因為它與任何已知的抗原受體都沒有很高的相似性[28]。

據(jù)不完全統(tǒng)計目前鯊總目存在超過450個不同的種[29]，鰩總目存在約560個不同的種[22]，由此可知板鰓亞綱魚類種類遠(yuǎn)多于駱駝科動物，為VNAR的開發(fā)提供了豐富的材料，由于當(dāng)前針對VNAR的研究集中于鯊總目，為敘述方便，本文所述VNAR特指鯊源單域抗體。

3 IgNAR的多樣性來源

與在其他脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子 (VnDnJnC)基因系統(tǒng)不同，板鰓亞綱魚類的免疫球蛋白(IgM、IgW和IgNAR) 基因以基因簇 (VDJC)n形式存在 (圖 2)。每個基因簇由 1個 V基因片段(Variable gene segment)、多個 D基因片段(Diversity gene segment)、1個 J基因片段 (Joining gene segment)和恒定區(qū)外顯子組成[30-31]。IgNAR也由基因簇中的基因編碼，其每個基因簇中含有3個D基因片段，因此通常需要4次基因重排，才能產(chǎn)生 1個完整的 VNAR基因序列[30]。由于IgNAR不含輕鏈，缺少重鏈和輕鏈的組合多樣性，同時IgNAR基因簇數(shù)量較少，因此IgNAR最主要的多樣性來源于長且高度突變的 CDR3區(qū)[32-33]。同時，CDR1、HV2和HV4區(qū)的突變也能增加IgNAR的多樣性[34]。此外對 VNAR的結(jié)構(gòu)分析表明，非典型半胱氨酸殘基的數(shù)量及位置的不同會導(dǎo)致VNAR抗原結(jié)合區(qū)的構(gòu)象存在巨大的差異[35-37]。因此，VNAR中的二硫鍵不僅可以增加結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還能產(chǎn)生各種各樣的構(gòu)象，從而進(jìn)一步擴(kuò)展IgNAR的多樣性。

圖2 高等脊椎動物和板鰓亞綱魚類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)座子及基因簇排列方式比較Fig. 2 Comparison of transposons and cluster arrangement of immunoglobulin genes in higher vertebrates and elasmbranchs.

4 VNAR的類型

根據(jù)CDR區(qū)和FR區(qū)中非典型半胱氨酸殘基及保守色氨酸殘基的位置和數(shù)量可以將VNAR劃分為不同的亞型[38]。到目前為止，已經(jīng)定義了3種主要的VNAR，分別稱為類型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[39-40]。此外有些VNAR只包含2個高度保守的典型半胱氨酸殘基，Liu等[41]和Streltsov等[28]將這些VNAR稱為Ⅱb型。同時將在 CDR1區(qū)含有保守色氨酸殘基以及只含有典型半胱氨酸殘基的VNAR稱為Ⅲb型[38]。所有當(dāng)前命名的VNAR類型見圖3。此外，2019年Feng等[42]通過對約119萬條來源于護(hù)士鯊的VNAR序列分析發(fā)現(xiàn)，護(hù)士鯊中存在約5%其他類型的VNAR，其不含或只含有1個半胱氨酸殘基。

迄今為止，Ⅰ型VNAR只在護(hù)士鯊中被發(fā)現(xiàn)，可能為該物種所特有[40]。該亞型 VNAR分別在FR2和FR4區(qū)中存在2個非典型半胱氨酸殘基，同時在CDR3區(qū)中也存在2個以上的半胱氨酸殘基。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)R2和FR4中存在的半胱氨酸殘基會與CDR3中的2個半胱氨酸殘基分別形成二硫鍵，從而形成1個緊密結(jié)構(gòu)[37](圖3)。需要注意的是，Ⅰ型VNAR由于二硫鍵的束縛導(dǎo)致CDR3區(qū)形成的指凸結(jié)構(gòu)的長度較短，難以識別蛋白裂隙深處的抗原表位[36]。

圖3 不同類型的VNAR示意圖 (左側(cè)為VNAR序列的特征圖，其中黑點為典型半胱氨酸殘基，白點為非典型氨基酸殘基，黑色實線和虛線為二硫鍵. 右側(cè)為不同類型VNAR的三維結(jié)構(gòu)模型，其是利用Pymol軟件對已報道的VNAR序列[41,44]進(jìn)行同源建模而獲得)Fig. 3 Schematic diagram of different types of VNAR. The characteristic diagrams of VNAR are on the left. The canonical cysteine residues (black dots), non-Canonical cysteine residues (white dots), disulphide bonds (solid and dashed lines), and conserved tryptophan (W) are shown in their relative positions. The three-dimensional structural models of different types of VNAR are on the right, which are obtained by homology modeling of reported VNAR sequences[41,44] using Pymol software.

Ⅱ型VNAR與Ⅰ型的不同之處是CDR1區(qū)和CDR3區(qū)中的2個非典型半胱氨酸會形成二硫鍵，使上述區(qū)域靠近，同時CDR3區(qū)可形成1個較長的指凸結(jié)構(gòu)，從而易于與蛋白裂隙等隱藏抗原表位結(jié)合。迄今為止，在所有研究的鯊魚中都發(fā)現(xiàn)了Ⅱ型VNAR[40]。

Ⅲ型VNAR與Ⅱ型類似，在CDR1和CDR3區(qū)分別存在1個非典型半胱氨酸，此外該亞型在CDR1區(qū)半胱氨酸殘基附近存在 1個保守的色氨酸殘基。需要注意的是Ⅲ型VNAR的多樣性較低。據(jù)推測，Ⅲ型VNAR是保護(hù)新生鯊魚抵御常見病原體的早期廣譜抗體，通常只在幼鯊 (<1歲) 中表達(dá)[32]。除Ⅲ型 VNAR外，所有類型的 VNAR都能產(chǎn)生高親和力[43]。

5 VNAR的主要特性

5.1 結(jié)構(gòu)特性

VNAR與哺乳動物傳統(tǒng)VH及駝源動物VHH在結(jié)構(gòu)上最大的不同是，其缺乏包含有CDR2區(qū)的C′和C″的 β鏈，同時在C-D和D-E的β鏈之間分別存在額外的高變區(qū) (HV2和HV4) (圖4)。2條 β鏈的缺失，使得 VNAR的分子量約為12 kDa，比VHH小約20%，是已知脊椎動物中尺寸最小的抗原結(jié)合域[37,43]。

基于有限的VNAR晶體結(jié)構(gòu)可知[36-37,44-45]，HV2區(qū)通常與CDR1、CDR3以及HV4區(qū)距離較遠(yuǎn) (圖 5)，有可能作為獨(dú)立抗原結(jié)合區(qū)而存在。Zielonka等[46]以上皮細(xì)胞粘附分子 EpCAM 特異性VNAR為模板，通過隨機(jī)化HV2區(qū) (包含9個氨基酸殘基) 構(gòu)建了酵母展示文庫，經(jīng)淘選獲得特異性針對細(xì)胞表面分子 CD3ε以及人 Fcγ的VNAR，新分離獲得的 VNAR依然保留了識別EpCAM的高親和力。該研究表明同一VNAR的不同區(qū)域可以作為獨(dú)立的抗原識別區(qū)識別不同的抗原。更為重要的是，該研究為雙特異性抗體的開發(fā)提供了新思路。

圖4 VH、VHH和VNAR結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 Structural schematic diagram of VH, VHH and VNAR.

圖5 不同類型VNAR與HEL結(jié)合模擬圖[36]Fig. 5 Simulation on the interaction between different types of VNAR and HEL[36].

5.2 功能特性

5.2.1 識別隱藏表位

針對一系列抗酶抗體的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)抗體與單域抗體可能優(yōu)先識別不同的抗原表位[37,47-48]。這主要是因為傳統(tǒng)抗體的 VH-VL界面通常是平面或者凹面，無法識別蛋白裂隙等隱藏抗原表位，而單域抗體的CDR3區(qū)通常較長，可以形成指凸結(jié)構(gòu)，從而能夠深入到酶活性中心等蛋白裂隙。目前有限的VNAR與酶免疫復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)研究證實了上述觀點，VNAR的CDR3區(qū)可以深入酶活性中心[37](圖5)。

不僅酶活性中心，VNAR也能識別其他折疊蛋白的裂隙。惡性瘧原蟲頂端膜抗原 1 (AMA1)是一種重要的蛋白抗原，存在于目前所有已驗證的瘧原蟲中，其含有1個進(jìn)化上保守的蛋白裂隙。Nuttall等利用半合成庫，淘選得到AMA1特異性的 VNAR，命名為 12Y-2[49]。隨后作者對 12Y-2進(jìn)行一系列突變，并對2株突變體與AMA1的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，VNAR的CDR3區(qū)能夠深入到AMA1的疏水裂隙中[44]。因此有學(xué)者認(rèn)為識別裂隙等隱藏抗原表位可能是單域抗體的基本特征[47]。

5.2.2 高水溶性和穩(wěn)定性

IgNAR 可在含有 350 mmol/L尿素和1 000 mOsm/kg滲透壓鹽離子的鯊魚血液中保持生物活性，主要是因為 IgNAR具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性[50-51]。通常認(rèn)為IgNAR的穩(wěn)定性可以歸因于以下 2個因素：1) 高水溶性，與傳統(tǒng)抗體 VH-VL界面相比，VNAR帶有大量的帶電和親水氨基酸殘基，如 Tyr37、Glu46、Lys82、Gln84、Arg101和Lys104，其中Glu46、Lys82和Lys104氨基酸殘基的保守性最強(qiáng)，其通過相互之間以及與水分子之間的氫鍵形成1個帶電的內(nèi)陷結(jié)構(gòu)。此外Tyr37作為免疫球蛋白超家族的保守氨基酸殘基與 Gln84、Arg101參與形成CDR3區(qū)與FR區(qū)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，最終使得VNAR形成親水性界面，提高溶解性并保護(hù)保守的免疫球蛋白疏水性骨架[28]；2) VNAR的特殊結(jié)構(gòu)，Buchner等發(fā)現(xiàn)與哺乳動物抗體相比，VNAR包含1個額外的鹽橋和延伸的疏水核。將這些增強(qiáng)穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到人抗體的可變區(qū)之后，可顯著提高其穩(wěn)定性[52]。此外VNAR內(nèi)部的二硫鍵也有利于提高其穩(wěn)定性[28,37,51]。

5.2.3 較強(qiáng)的組織穿透性

由于眼部特殊的構(gòu)造，抗體等大分子藥物通常只能通過玻璃體注射等方式給藥，往往存在感染以及視網(wǎng)膜脫落等副作用。因此，急需開發(fā)組織穿透性強(qiáng)的藥物，以便改變給藥途徑。葡萄膜炎是眼科常見的致盲性疾病，其成因復(fù)雜，多屬于自身免疫性疾病。誘導(dǎo)共刺激因子配體 (ICOSL)與共刺激因子 (ICOS) 相互作用，在T細(xì)胞活化過程中起著重要作用。通過阻斷這種相互作用可以抑制T細(xì)胞的完全活化，從而改善疾病癥狀。Kovaleva等[53]利用 ICOSL免疫的護(hù)士鯊建立免疫庫，并淘選得到特異性識別ICOSL的VNAR。作者利用角膜劃傷的小鼠模型研究了VNAR穿越組織的能力，通過滴加的方式給小鼠模型用藥，藥物包括 VNAR、VNAR-Fc以及 mAb，給藥20 min之后，只有VNAR可以穿透角膜，在小鼠眼睛的前房被發(fā)現(xiàn)。該結(jié)果顯示了VNAR具有較強(qiáng)的組織穿透性。

6 VNAR的制備技術(shù)

6.1 免疫庫

制備免疫庫首先需要對鯊魚等動物進(jìn)行免疫，目前用于產(chǎn)生高親和力IgNAR的免疫方案已有報道[54-55]。然而，與哺乳動物相比，鯊魚的免疫周期通常較長[27,38]。Dooley等以雞蛋溶菌酶(HEL) 為抗原免疫護(hù)士鯊，建立了首個VNAR噬菌體展示免疫文庫，并從中淘選獲得多株VNARs，其中性能最好的被命名為5A7，其親和力為20 nmol/L[20]。需要注意的是，并不是所有測試的鯊魚種類都能產(chǎn)生適應(yīng)性IgNAR免疫應(yīng)答。Crouch等[56]以人血清白蛋白 (HSA) 以及HEL作為抗原免疫斑點貓鯊Scyliorhinus canicula，經(jīng)過長達(dá)37周的免疫程序，沒有發(fā)現(xiàn)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性IgNAR的證據(jù)。

6.2 天然庫

由于天然庫缺乏免疫過程中刺激機(jī)體所發(fā)生的體細(xì)胞突變，導(dǎo)致使用該策略淘選得到的VNARs的親和力通常較低。不過使用數(shù)量較多的動物，通過增加文庫庫容以及多樣性的方式，有助于淘選獲得高親和力的 VNARs。Feng等[42]基于EASeL技術(shù)用6條護(hù)士鯊構(gòu)建噬菌體展示天然庫，其庫容可達(dá) 1.2×1010，作者從該天然庫中淘選獲得特異性識別癌癥治療相關(guān)抗原 (GPC3、HER2和PD1)、病毒刺突蛋白 (SARS和MERS)以及假單胞菌外毒素 (PE38) 的 VNARs，其中1個識別 PE38的 VNAR具有較高的親和力(10.1 nmol/L)。該研究表明利用庫容大、多樣性豐富的天然庫也可淘選得到高親和力的VNAR。

6.3 半合成庫

隨著對VNAR結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)知，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)VNAR的多樣性主要來源于長且高度突變的CDR3區(qū)。因此以VNAR作為框架，通過CDR3區(qū)的隨機(jī)化構(gòu)建半合成VNAR文庫，可以獲得類似甚至優(yōu)于天然庫的效果。Nuttall等以斑紋須鯊Orectolobus maculatesVNAR為框架，通過隨機(jī)化CDR3區(qū) (包含16或者18個氨基酸殘基) 構(gòu)建了第1個VNAR噬菌體展示半合成文庫，并利用其淘選得到針對 AMA1的 VNAR，其親和力為200 nmol/L[57]。

7 VNAR的親和力成熟策略

7.1 隨機(jī)突變

Nuttal等[49]利用易錯 PCR在針對 AMA1的VNAR (12Y-2) 的CDR1和CDR3區(qū)進(jìn)行隨機(jī)突變并建立突變庫，隨后通過嚴(yán)格淘選，使得VNAR突變株的親和力提高了10倍。此外該研究團(tuán)隊還利用來源于Qβ噬菌體的低保真RNA聚合酶以及核糖體展示文庫技術(shù)構(gòu)建突變庫，通過嚴(yán)格淘選，使得VNAR突變株的親和力提高了23倍[58]。

7.2 定點突變

Fennell等[59]以HEL特異性結(jié)合的VNAR為模型，利用核糖體展示技術(shù)以及易錯 PCR對VNAR序列中各氨基酸的功能進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。通過反復(fù)突變以及淘選，獲得320個含有突變氨基酸并保留抗體活性的序列，經(jīng)測序及分析，作者確定了保持結(jié)構(gòu)及功能完整性的關(guān)鍵位點、與親和力密切相關(guān)的位點以及允許高度突變的位點。其中3個位點氨基酸的突變 (A1D、S61R和G62R) 可以提高親和力，最終結(jié)合這3種突變，使VNAR突變體的親和常數(shù)達(dá)到460 pmol/L，比野生型5A7提高了20倍。該工作通過對VNAR序列中各氨基酸功能的系統(tǒng)性研究，為VNAR的定點突變提供了參考。

7.3 分步式突變

Zielonka等[60]首先以條紋斑竹鯊Chiloscyllium plagiosumVNAR為框架，通過隨機(jī)合成 CDR3區(qū) (包含 12個氨基酸殘基) 構(gòu)建了酵母展示文庫，并以 3種腫瘤標(biāo)志物上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、肝配蛋白A受體2 (EphA2) 以及人絲氨酸蛋白酶 (HTRA1) 為靶分子淘選 VNAR，經(jīng)過 3輪淘選后，收集 VNARs并以其為模板隨機(jī)合成CDR1區(qū) (包含5個氨基酸殘基)，并進(jìn)行再次淘選。最后通過對淘選得到的 VNARs序列分析，發(fā)現(xiàn)針對EpCAM的3株VNARs擁有完全相同的CDR3區(qū)且與最初淘選得到的VNAR序列相同，通過親和力分析發(fā)現(xiàn)，CDR1區(qū)突變的 3株VNARs的平均親和常數(shù)為 11.2 nmol/L，比原始VNAR的親和力提高了 65倍。針對 HTRA1的VNAR也存在類似的現(xiàn)象。以上結(jié)果證明，通過對 CDR區(qū)的分步式突變可以獲得高親和力的VNAR，這種CDR區(qū)的分步式體外親和力成熟策略與護(hù)士鯊免疫系統(tǒng)中 IgNAR親和力成熟的過程類似。

8 VNAR的人源化改造

通過序列分析，發(fā)現(xiàn)VNAR與人源抗體可變區(qū)之間氨基酸的同源性約為25%–30%[61]，然而基于現(xiàn)有VNAR的晶體數(shù)據(jù)可知，VNAR的結(jié)構(gòu)與人源抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，因此可以通過框架移植實現(xiàn)對VNAR的人源化改造。目前首個被人源化改造的VNAR是由Müller等從人血清白蛋白 (HSA) 免疫的白斑角鯊Squalus acanthias噬菌體展示文庫中分離獲得，其最初被命名為 E06。E06自身并不能用于疾病治療，藥物分子通過與E06進(jìn)行融合可以增加在血清中的半衰期，從而提高藥物的療效[62]。為了降低 E06的免疫原性，利用與VNAR相似度最高的人類免疫球蛋白可變區(qū)框架DPK9對E06進(jìn)行人源化改造。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人源化E06的親和力及特異性得到了較好的保留。隨后該團(tuán)隊以人源化huE06v1.10為模板利用易錯PCR進(jìn)行隨機(jī)突變并構(gòu)建突變庫，經(jīng)過淘選獲得一系列突變株。作者利用樹突細(xì)胞-T細(xì)胞系統(tǒng) (DC-T) 測試突變株的免疫原性，發(fā)現(xiàn) BA11等突變株幾乎沒有免疫原性。最終基于親和力、免疫原性以及半衰期等數(shù)據(jù)，認(rèn)為突變株 BA11最具臨床應(yīng)用價值，并將其重命名為 NDure?[63-64]。

值得注意的是，除了上述傳統(tǒng)人源化改造技術(shù)外，Nuttall等基于VNAR晶體結(jié)構(gòu)類似于免疫球蛋白超家族I-set類群的現(xiàn)象，提出以人源I-set類群分子 (如人類神經(jīng)細(xì)胞粘附分子) 為模板進(jìn)行VNAR的人源化改造，從而降低VNAR免疫原性的設(shè)想[65]。

9 VNAR的應(yīng)用

VNAR所具備的分子量小、親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、溶解度好、組織穿透性強(qiáng)以及可識別隱藏抗原表位等特性，使得其在應(yīng)用時具有產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、易儲存以及貨架期長等優(yōu)點，在藥物開發(fā)、體外診斷以及免疫檢測等領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注 (表1)。

表1 VNAR在各領(lǐng)域的應(yīng)用Table 1 Applications of VNARs in various fields

9.1 VNAR在藥物開發(fā)中的應(yīng)用

人腫瘤壞死因子 TNFα (rhTNFα) 是由免疫細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白。細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激機(jī)體時會產(chǎn)生過量的rhTNFα，從而引發(fā)中毒性休克、腎上腺損害等嚴(yán)重疾病。因此，rhTNFα抑制劑的開發(fā)備受研究者的關(guān)注。Camacho-Villegas等[66]利用佛氏虎鯊Heterodontus francisci制備噬菌體免疫文庫，經(jīng)過 4輪淘選分離獲得針對rhTNFα的VNAR，并命名為T43。通過細(xì)胞實驗證實T43具有中和rhTNFα的能力。同時利用脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠模型證實T43能顯著降低小鼠的死亡率。T43所表現(xiàn)出的良好的治療效果以及組織滲透性等，使其有潛力成為免疫治療藥物。

9.2 VNAR作為酶抑制劑的應(yīng)用

抗體作為酶抑制劑時，可以通過改變酶活性位點構(gòu)象或者直接結(jié)合酶活性位點等方式實現(xiàn)對酶活性的抑制[47]。Aurora-A激酶是一類進(jìn)化上高度保守的蘇氨酸激酶，參與細(xì)胞有絲分裂過程，當(dāng)其過量表達(dá)時，會導(dǎo)致出現(xiàn)非整數(shù)倍染色體，使得細(xì)胞增殖異常，最終誘發(fā)癌癥。因此，Aurora-A激酶抑制劑的開發(fā)受到廣泛關(guān)注。Burgess等[67]以斑紋須鯊VNAR為框架制備半合成庫，獲得特異性識別Aurora-A激酶的VNAR，命名為D01。晶體結(jié)構(gòu)顯示D01通過破壞Aurora-A激酶的Lys-Glu鹽橋使得酶構(gòu)象改變，從而失去活性。

Dooley等[37]利用雞卵清溶菌酶 (HEL) 免疫的護(hù)士鯊構(gòu)建噬菌體免疫文庫，并淘選得到多株高親和力的VNARs，包括5A7等[48]。隨后Stan field等通過 5A7與 HEL共結(jié)晶的方式，系統(tǒng)性研究了VNARs的晶體結(jié)構(gòu)以及5A7與HEL的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)5A7中只有CDR1和CDR3區(qū)會與HEL接觸，且CDR3區(qū)的Arg100與Tyr101會深入到HEL的酶活性中心，從而抑制HEL的酶活性。

9.3 VNAR作為細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用

乙型肝炎病毒前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被加工成分泌型乙型肝炎病毒抗原 (HBeAg)，后者可引起慢性感染。Walsh等[68]以斑紋須鯊VNAR為框架制備半合成庫，并淘選到1株特異性結(jié)合乙型肝炎病毒前體蛋白的VNAR，命名為H6。為了評估H6作為細(xì)胞內(nèi)抗體結(jié)合乙型肝炎病毒前體蛋白以減少 HBeAg分泌的效果，H6基因被插入到pCMV/ER表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入pTRE細(xì)胞中，通過蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn) H6能夠顯著降低前體蛋白及HBeAg的含量，表明VNAR能在真核細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境下功能性表達(dá)并發(fā)揮效應(yīng)，顯示了VNAR作為細(xì)胞內(nèi)抗體的潛力。

9.4 VNAR在疾病診斷中的應(yīng)用

早期診斷對于疾病的及時發(fā)現(xiàn)及治療至關(guān)重要，尤其是對于腫瘤等嚴(yán)重疾病。目前針對多種腫瘤標(biāo)志物的VNAR被成功開發(fā)。Zielonka等[60]以條紋斑竹鯊VNAR為框架通過分步式隨機(jī)合成CDR3區(qū)和CDR1區(qū)，構(gòu)建了酵母展示文庫，分別淘選得到識別 3種腫瘤標(biāo)志物 (EpCAM、EphA2以及HTRA1) 的VNAR，其親和力都為納摩爾級，為后續(xù)建立免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

9.5 VNAR在致病微生物檢測中的應(yīng)用

Goodchild等[75]利用埃博拉病毒免疫的小鼠和護(hù)士鯊制備噬菌體免疫文庫，通過固相淘選法得到2株特異性識別病毒核蛋白 (Viral nucleoprotein，NP) 的VNAR，以及2株特異性識別埃博拉病毒基質(zhì)蛋白 (Viral matrix protein，VP40) 的ScFv。其中NP蛋白與病毒 RNA形成復(fù)合物并被病毒包膜包裹，通常難以產(chǎn)生針對NP的傳統(tǒng)抗體。上述淘選結(jié)果證明 VNAR傾向于識別傳統(tǒng)抗體難以識別的抗原表位。作者發(fā)現(xiàn)VNAR與mAb及ScFv相比，對熱變性具有更強(qiáng)的抵抗力。VNAR在80 ℃條件下處理3 h依然能保留約50%的生物活性，而mAb及ScFv則分別在70 ℃以及50 ℃下處理3 h后完全喪失生物活性。VNAR優(yōu)越的熱穩(wěn)定性使其具有成為現(xiàn)場免疫檢測試劑的潛力。

9.6 VNAR在食品安全危害因子檢測中的應(yīng)用

Liu等[76]以白斑角鯊VNAR為框架通過隨機(jī)合成不同長度的CDR3區(qū)構(gòu)建了噬菌體合成文庫，利用固相淘選法，獲得特異性識別葡萄球菌腸毒素B(SEB)、蓖麻毒素 A (BoNT/A) 和肉毒桿菌毒素(Ricin) 的 VNAR。作者發(fā)現(xiàn) VNARs針對 SEB、BoNT/A以及Ricin的最低檢測限分別是10 ng/mL、40 ng/mL以及1 μg/mL，展示了VNAR應(yīng)用于食品安全危害因子檢測的潛力。

10 VNAR作為免疫試劑和治療藥物的優(yōu)勢和劣勢

VNAR是目前在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的尺寸最小的抗原結(jié)合域，以下因素使其作為免疫試劑或藥物時具有優(yōu)勢：1) 源于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)：IgNAR是板鰓亞綱魚類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。漫長的進(jìn)化過程以及嚴(yán)酷的生理環(huán)境使得VNAR形成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，具備極強(qiáng)的穩(wěn)定性以及重折疊能力。同時通過抗原免疫利用IgNAR的體內(nèi)親和成熟可獲得高親和力的VNAR。2) 尺寸小以及組織穿透性強(qiáng)：由于缺乏C′和C″的β鏈，導(dǎo)致 VNAR的分子量僅為 12 kDa。小尺寸使得VNAR作為藥物時，具有較強(qiáng)的組織穿透性[53,69]。3) 識別隱藏抗原表位的傾向：與駝源VHH類似，VNAR的CDR3區(qū)能形成指凸結(jié)構(gòu)，識別傳統(tǒng)抗體無法識別的隱藏抗原表位。4) VNAR結(jié)構(gòu)多樣性大：同為單域抗體的駝源 VHH僅存在類似于Ⅱ型VNAR的結(jié)構(gòu)，即具有連接CDR1和CDR3的二硫鍵，而VNAR到目前為止至少存在5種不同的結(jié)構(gòu)類型。因此，多樣化的VNAR結(jié)構(gòu)為其識別不同類型的靶分子奠定了基礎(chǔ)。5) 與人類進(jìn)化距離遠(yuǎn)：由于鯊總目魚類與人類在進(jìn)化上距離較遠(yuǎn)，可用于開發(fā)針對保守的哺乳動物蛋白等靶點的抗體藥物。當(dāng)前離臨床應(yīng)用最近的NDure?，其靶分子即為保守的哺乳動物蛋白HAS。6) 易于大規(guī)模生產(chǎn)：VNAR結(jié)構(gòu)簡單，由單基因表達(dá)，可以通過各種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有利于降低成本。7) 商業(yè)競爭少：當(dāng)前對于 VNAR的研究較少，沒有形成嚴(yán)密的專利保護(hù)。

當(dāng)然，VNAR作為免疫試劑或治療藥物時也存在諸多不可回避的問題：1) 鯊魚飼養(yǎng)困難：普通實驗室飼養(yǎng)及免疫鯊魚存在較大困難。2) 免疫周期長：鯊魚免疫周期較長 (4–6個月)，而駱駝科動物則只需要3個月左右。較長的免疫周期會增加飼養(yǎng)成本以及抗體開發(fā)周期。3) 免疫原性大：由于鯊總目魚類與人類進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，因此在開發(fā)基于VNAR的藥物時，VNAR可能存在較大的免疫原性，需要進(jìn)行人源化改造。

11 結(jié)論與展望

VNAR是迄今為止在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的尺寸最小的抗原結(jié)合域。由于制備困難等原因，目前國內(nèi)外對其研究較少，特別是國內(nèi)，鮮有團(tuán)隊開展相關(guān)工作。近年來，隨著駝源 VHH在各個領(lǐng)域日漸廣泛的應(yīng)用，尤其是首個VHH藥物 (Cablivi?) 先后被EMA和FDA批準(zhǔn)上市之后，同屬單域抗體的VNAR也日益成為抗體領(lǐng)域的研究熱點。與 VHH相比，雖然針對多種靶分子的VNAR被淘選得到，但大多數(shù)只是研究了VNAR的特異性、親和力和穩(wěn)定性等性能，其作為免疫試劑或者藥物的應(yīng)用性研究則較少。然而 VNAR較傳統(tǒng)抗體所擁有的尺寸小、穩(wěn)定性強(qiáng)、親和力高、識別隱藏抗原表位以及易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，注定其在免疫檢測和治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。更為重要的是，目前用于VNAR開發(fā)的鯊魚種類不到10種，且未見鰩源VNAR的報道，而現(xiàn)存板鰓亞綱魚類超過千余種(鯊總目約450種，鰩總目約560種)，能夠為VNAR的研究提供極為豐富的材料。有理由相信，隨著研究的深入能夠發(fā)現(xiàn)VNAR更多的結(jié)構(gòu)及功能特性，在拓展 VNAR來源的同時有望進(jìn)一步豐富抗體小型化的理論基礎(chǔ)。