橙色熒光蛋白的研究進(jìn)展及其應(yīng)用

彭穩(wěn)，何培民，施定基,2，賈睿

1 上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306

2 中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093

細(xì)胞生物學(xué)的研究需要對活細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過程和細(xì)胞通路進(jìn)行詳細(xì)、準(zhǔn)確的描述。各種熒光染料由于其毒性所以不能在活體細(xì)胞中很好地使用，而熒光蛋白 (Fluorescent protein，F(xiàn)Ps) 可以在光譜成像中顯示出明亮的熒光[1]，在活細(xì)胞、深層組織和全身的成像容易[2]，也就成為更好的替代品。隨著熒光顯微技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)Ps可作為探針以跟蹤細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用，追蹤特定代謝產(chǎn)物的代謝途徑，也可以結(jié)合到傳感器中將細(xì)胞活動轉(zhuǎn)化為生物信號[3-4]。

1962年，下村修等在維多利亞管狀水母Aequorea victoria體內(nèi)首次分離得到綠色FPs[5]。此后綠色FPs在生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛運用，但是其發(fā)射光譜僅僅局限于440–529 nm，細(xì)胞內(nèi)成像背景較高，且不能解決皮下深層組織的成像問題[6]。1999年，Matz等從印度洋-太平洋地區(qū)的珊瑚蟲 (Discosomasp.) 中分離并改進(jìn)得到紅色FPs——DsRed[7]，但由于其四聚體的特性限制了其在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用[8-9]。

近年來，蛋白質(zhì)工程學(xué)已經(jīng)成功地將天然熒光蛋白的激發(fā)光譜擴(kuò)展到整個可見光波段甚至遠(yuǎn)紅外波長，從而產(chǎn)生了一系列熒光蛋白[10]。當(dāng)使用FPs時，通常需要同時成像多個光譜通道的圖像以分析多種生物活動，或在定量研究中使用一個熒光團(tuán)作為參照[11]，所以豐富多樣的熒光蛋白對生物學(xué)研究的推動作用顯而易見。橙色熒光蛋白的出現(xiàn)使熒光蛋白家族的光譜范圍進(jìn)一步完善，它具有與常用的紅色以及綠色熒光蛋白顯著差異的發(fā)射波峰，使研究者在進(jìn)行多熒光標(biāo)記等實驗時具有更多樣的選擇。同時它具有在顯微鏡下細(xì)胞自身熒光背景較暗、光散射較少、可用于活體組織成像、發(fā)射波長較長等優(yōu)勢。因此，現(xiàn)在更多的研究集中在橙色FPs的開發(fā)中。

1 橙色熒光蛋白的種類及其特點

1.1 常規(guī)橙色熒光蛋白

目前報道的常規(guī)橙色 FPs主要來源于兩種親本蛋白：Kusabira-Orange (KO)[12]、DsRed[13]。KO最初是從石質(zhì)珊瑚Fungia concinna中分離出來的，通過在其N端引入10個氨基酸殘基從而可為蛋白質(zhì)提供明亮的橙色熒光[12]，KO激發(fā)和發(fā)射峰分別為548 nm和561 nm[14]。但由于KO是四聚體結(jié)構(gòu)，后來又通過引入另外22個氨基酸突變得到了一個單分子變體mKO，其保持了原有的亮度和熒光特性，最大發(fā)射峰略有變化 (559 nm)，分子量為28.1 kDa[14]。mKO被進(jìn)一步改進(jìn)，產(chǎn)生兩個亮度更高的變體 (mKO2[15]和mKOk[16])。

DsRed衍生物中橙色FPs最多，共有8種，Shaner等在DsRed的單分子變體mRFP1[17]基礎(chǔ)上改進(jìn)得到了mHoneydew、mBanana和mOrange[18]。mOrange的亮度比同為DsRed衍生物的mCherry[18]要高出3倍以上。雖然mOrange的亮度較高，但它對酸的敏感性也非常高，pKa值為6.5。mOrange的高消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率使其成為潛在的熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET) 受體。隨后，Shaner等又在mOrange的基礎(chǔ)上，開發(fā)出mOrange2[19]，其光穩(wěn)定性是mOrange的25倍以上。此外，Strack等通過改造 DsRed獲得一種低細(xì)胞毒性的四聚體紅色FPs——DsRed-Express 2[9,20]，并以此蛋白作為模板，在保留其低細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上創(chuàng)造了橙色變體E2-Orange。

1.2 具有特殊表型的熒光蛋白

此外，還有一些具有獨特表型的橙色 FPs，具有大斯托克位移 (Large stoker shift，LSS) 的橙色 FPs有兩種：LSSmOrange[21]以及亮度更高的CyOFP1[22]，LSSmOrange是在mOrange的基礎(chǔ)上突變得到的變體，CyOFP1是在mNeptune2的基礎(chǔ)上定向突變得到，具有激發(fā)光為綠色以及高亮度的特點。除此之外還有具有從橙色到遠(yuǎn)紅色熒光態(tài)的光轉(zhuǎn)化特性的 FPsPSmOrange和PSmOrange2[23]。

另外，在FPs發(fā)色團(tuán)中還有一種被稱為光敏劑的發(fā)色團(tuán)，這種發(fā)色團(tuán)被光照射后能夠產(chǎn)生活性氧(ROS)，進(jìn)而滅活目的蛋白，即發(fā)色基團(tuán)輔助光失活 (Chromophore-assisted light inactivation，CALI)技術(shù)[29-30]，對 DNA、蛋白質(zhì)、脂肪等造成損傷，影響細(xì)胞的代謝或增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[31]。Sarkisyan等報道了一種紅色 FPsKillerRed的橙色突變體KillerOrange，當(dāng)其被藍(lán)光或綠光照射時，它會產(chǎn)生ROS從而殺傷細(xì)胞[32]，所有熒光蛋白特性羅列在表1中。

2 橙色熒光蛋白結(jié)構(gòu)的研究

2.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

大部分橙色熒光蛋白具有相似的 β-桶狀的結(jié)構(gòu)。以 mKO 為例 (圖 1)，11個 β-折疊鏈組成 β-筒的外周結(jié)構(gòu)，筒兩端分別被一些分子量較小的短α-螺旋覆蓋，組成發(fā)色團(tuán)的 3個氨基酸殘基與 α-螺旋共價相連，位于圓筒中央螺旋中部。β-圓筒與短 α-螺旋形成致密的結(jié)構(gòu)域，使配體不能擴(kuò)散進(jìn)入，發(fā)色團(tuán)被嚴(yán)格保護(hù)在筒內(nèi)，從而形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，不易猝滅[33]。

2.2 發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)

通過研究，F(xiàn)Ps發(fā)色團(tuán)自成熟和光誘導(dǎo)化學(xué)的基本原理已經(jīng)相對清楚[34]。FPs的光譜特性是由其發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)決定的，橙色熒光蛋白的發(fā)色團(tuán)由3個氨基酸殘基組成，后兩個較為保守，一般為酪氨酸和甘氨酸，第一位的氨基酸變化最大，也是此位氨基酸的側(cè)鏈發(fā)生環(huán)化，形成特殊的三環(huán)發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)，從而擴(kuò)展電子共軛體系為熒光蛋白提供橙色的熒光[18]。

表1 橙色熒光蛋白及其特性Table 1 Orange fluorescent protein and its characteristics

圖1 mKO的三維結(jié)構(gòu)[33]Fig. 1 Representation of the three-dimensional structure of mKO[33].

mKO和KO具有相同的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)，發(fā)色團(tuán)都由C-Y-G三肽組成 (圖2A)，Cys發(fā)生環(huán)化形成第 3個環(huán)，擴(kuò)展了顯色團(tuán)共軛體系[35]。DsRed的發(fā)色團(tuán)由 Q-Y-G組成，連接發(fā)色團(tuán)的咪唑啉酮環(huán)和前一位氨基酸殘基的?；鶃啺坊鶊F(tuán)擴(kuò)展了共軛體系從而導(dǎo)致了紅色的熒光，DsRed中發(fā)色團(tuán)的氨基酸殘基的改變產(chǎn)生了3種橙色FPs：mHoney-dew(M-W-G)、mBanana (C-Y-G) 和 mOrange (T-Y-G)。在mOrange中，位于66位的Gln被Thr取代，從而形成色團(tuán)中第 3個雜環(huán) (惡唑環(huán))，導(dǎo)致橙色的光譜特性 (圖2B)[7,34]。在DsRed-Express2的橙色衍生物E2Orange的設(shè)計中，將相同的Q66T突變體引入 DsRed-Express2中，從而產(chǎn)生了橙色的激發(fā)和發(fā)射峰。值得一提的是mHoneydew的發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)很特別，與其他 DsRed衍生物不同，它的發(fā)色團(tuán)中的Tyr被取代為Trp (圖2C)，但是這個特殊的結(jié)構(gòu)并沒有給它帶來良好的熒光表現(xiàn)，它的熒光強(qiáng)度只有 DsRed的 3%，包括同為衍生物的mBanana，它們的特性都不是很良好，所以應(yīng)用的實例也較少。

圖2 橙色熒光蛋白的發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)[36]Fig. 2 The structure of the chromophore of the orange fluorescent protein[36].

2.3 關(guān)鍵位點突變對二級結(jié)構(gòu)的影響

LSSmOrange、PSmOrange和 PSmOrange2與親本 mOrange具有相同的顯色團(tuán)結(jié)構(gòu)。它由對羥基苯基、咪唑啉酮和由T66側(cè)鏈環(huán)化的2-羥基二氫惡唑環(huán)組成。在LSSmOrange中，大斯托克位移的產(chǎn)生源于分子內(nèi)部的激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移[21]，而包括I161D、M163L和W143M在內(nèi)的關(guān)鍵突變對發(fā)色團(tuán)周圍環(huán)境造成顯著影響從而為激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供條件 (圖 3)。W143M 置換使 L165側(cè)鏈向蛋白的內(nèi)部轉(zhuǎn)移，W143M和 M163L均使發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)趨向扁平，由這兩個突變引起 S146側(cè)鏈構(gòu)象的改變，從而使S146可以作為從發(fā)色團(tuán)的對羥基苯環(huán)到D161的羧基之間激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的中間傳遞體[36]。與LSSmOrange不同，CyOFP1的大斯托克位移源于K160與發(fā)色團(tuán)的酚基團(tuán)之間的氫鍵，激發(fā)態(tài)質(zhì)子從發(fā)色團(tuán)傳遞到K160的側(cè)鏈從而完成激發(fā)態(tài)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移[22]。

在 PSmOrange和 PSmOrange2中，Q64L突變對于其光轉(zhuǎn)換特性至關(guān)重要。這種突變破壞了64位谷氨酰胺和95位精氨酸之間的氫鍵，Y99側(cè)鏈羧基與I60主鏈羰基形成新的水介導(dǎo)的氫鍵。這兩種變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)可以被氧化劑或光刺激，從而轉(zhuǎn)化為遠(yuǎn)紅外的發(fā)光狀態(tài) (圖4)。光轉(zhuǎn)換伴隨著65位 Phe/Ile (PSmOrange/PSmOrange2) 上 Cα1-C鍵的斷裂，使畸變的顯色團(tuán)恢復(fù)，并將 2-羥基二氫惡唑氧 OH-基團(tuán)轉(zhuǎn)化為 C=O，使發(fā)色團(tuán)共軛體系得到擴(kuò)展。這是PSmOrange和PSmOrange2中大量(約90 nm)熒光紅移的主要原因。PSmOrange2中A217S的取代使215位Glu向發(fā)色團(tuán)靠近，并使其與發(fā)色團(tuán)形成氫鍵，增加了發(fā)色團(tuán)的極化和量子產(chǎn)率[36]。

圖3 mOrange與LSSmOrange的結(jié)構(gòu)差異[36]Fig. 3 The difference between mOrange and LSSmOrange[36].

圖4 mOrange與PSmOrange的結(jié)構(gòu)差異[36]Fig. 4 The difference between mOrange and PSmOrange[36].

KillerOrange以及mKillerOrange是KillerRed的突變體，三肽結(jié)構(gòu)為Q-W-G，Trp替換KillerRed發(fā)色團(tuán)中的 Tyr，在這兩種 FPs中，發(fā)色團(tuán)的第66位Trp與第159位Gln形成氫鍵，以維持一種不尋常的反式-順式結(jié)構(gòu)。這種順反式構(gòu)象與沿著β-桶軸從發(fā)色團(tuán)延伸到筒體末端的充水通道是關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)特征，這兩者為兩種光敏劑提供了明亮的橙色熒光和光毒性[37]。

3 橙色熒光蛋白的應(yīng)用

3.1 橙色熒光蛋白作為標(biāo)記蛋白的應(yīng)用

橙色熒光蛋白所在的發(fā)射光波段，在某些特殊細(xì)胞中可以有效避開細(xì)胞自身的背景熒光。除此之外，橙色熒光在哺乳動物的深部組織成像優(yōu)勢巨大，因為相關(guān)組織對橙光及紅光的通透性較好。某些變體自身的優(yōu)異特性也使其成為標(biāo)記蛋白的良好選擇，比如大斯托克位移FPs在多熒光標(biāo)記中的應(yīng)用。

3.1.1 在微藻及植物中的應(yīng)用

藍(lán)藻作為可以用于生物燃料和化學(xué)合成應(yīng)用的模式生物越來越受到關(guān)注[38]，藍(lán)藻自身攜帶大量的光合色素，當(dāng)對藍(lán)藻進(jìn)行熒光標(biāo)記時，這些光合色素會與FPs競爭吸收激發(fā)光源，吸收FPs發(fā)射的熒光，并且放出自身熒光信號干擾檢測，所以選擇合適的標(biāo)記蛋白對藍(lán)藻的熒光標(biāo)記至關(guān)重要。Ruffing等選擇mOrange作為標(biāo)記蛋白，探索其在Synechococcussp. PCC7002中的標(biāo)記性能，結(jié)果顯示可以在光譜圖上區(qū)分轉(zhuǎn)基因型和野生型藍(lán)藻。這為使用 mOrange作為藍(lán)藻生物中的標(biāo)記蛋白提供參考和依據(jù)[39]。之前的研究也表明，橙色和紅色FPs適合萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii[40]的胞質(zhì)表達(dá)。

除此之外，橙色FPs也在植物中作為標(biāo)記蛋白來使用。Mann等將mOrange等6種FPs基因分別轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示橙色熒光蛋白可以用于植物轉(zhuǎn)化[41]。在豆科植物中，過多的根瘤形成會抑制植物生長。植物激素脫落酸(ABA) 可以抑制根瘤的形成，ljglu1基因是一種ABA反應(yīng)基因。Osuki使用mOrange標(biāo)記LjGlu1蛋白，從而觀察其在根組織和結(jié)節(jié)中的定位[42]，表明LjGlu1的表達(dá)是植物自身對根瘤菌感染作出的應(yīng)激反應(yīng)，并在根組織外發(fā)揮作用，從而抑制感染。發(fā)動蛋白和網(wǎng)格蛋白參與植物包膜囊泡的形成，F(xiàn)ujimoto等用GFP和mKO分別標(biāo)記參與其中的發(fā)動蛋白以及網(wǎng)格蛋白，根據(jù)它們的聚集狀況從而觀察它們在植物內(nèi)吞過程中的分子機(jī)制[43]。

3.1.2 在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用

Ⅱ型糖尿病是一種非胰島素依賴型糖尿病，葡萄糖轉(zhuǎn)運體4 (GLUT4) 是將葡萄糖轉(zhuǎn)運入細(xì)胞的主要蛋白之一，是治療Ⅱ型糖尿病的靶點，其廣泛分布于骨骼肌、心肌、脂肪組織、腎臟和大腦[44]。Zhao等通過構(gòu)建融合表達(dá)mOrange和GLUT4的細(xì)胞株系，從而觀察細(xì)胞內(nèi)GLUT4動態(tài)變化及其與質(zhì)膜融合狀況[45]。在鳥類和哺乳動物的皮膚色素沉著過程中，黑色素在黑素細(xì)胞中合成，然后轉(zhuǎn)移到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞中，使含有黑色素的細(xì)胞覆蓋全身。Murai等用EGFP和mOrange分別標(biāo)記黑素細(xì)胞以及角質(zhì)形成細(xì)胞，探索兩種細(xì)胞間的相互作用[46]，以了解細(xì)胞間相互作用機(jī)制以及體內(nèi)皮膚色素沉著規(guī)律。

值得一提的是，CyOFP1的激發(fā)光為綠色，發(fā)射光為橙色，其開發(fā)者Chu等[22]利用這一特性，將其與綠色熒光蛋白分別標(biāo)記到黑素瘤細(xì)胞的不同部位，從而通過單一的激發(fā)光源同時觀察兩個光通路的蛋白標(biāo)記狀況，這節(jié)省了布置雙激光發(fā)射器的成本。

3.1.3 在病毒中的應(yīng)用

Etienne等將包括mOrange在內(nèi)的多種FPs融合到單純皰疹病毒1型 (HSV-1) 菌株的小衣殼蛋白 (VP26) 上，并且進(jìn)入人黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，從而探究病毒在體內(nèi)的感染機(jī)制[47]。Chen等在竹花葉病毒 (BaMV) 感染宿主的過程中發(fā)現(xiàn)了一個上調(diào)的基因，該基因編碼的蛋白包括一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)與一個跨膜結(jié)構(gòu)域，該蛋白可能具有泛素 E3連接酶的功能，并將其命名為泛素 E3連接酶(NbUbE3R1)。實驗者將其與橙色FPs融合表達(dá)，進(jìn)一步研究 NbUbE3R1在 BaMV積累中的功能作用[48]。

3.2 橙色熒光蛋白在FRET技術(shù)中的應(yīng)用

基于熒光壽命成像顯微鏡 (FLIM) 的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 測量正越來越多地用于探索生命系統(tǒng)中的分子構(gòu)象和分子間相互作用。在適當(dāng)位置的受體存在的情況下，可以根據(jù)供體熒光團(tuán)的興奮狀態(tài)時間的縮短來判斷其標(biāo)記的蛋白質(zhì)之間的分子構(gòu)象。傳統(tǒng)的青色 FPs由于其耐光性差、低量子產(chǎn)量等缺點在熒光共振成像中的應(yīng)用還達(dá)不到理想的效果[49]，mOrange、mKO等由于其較高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率使其具有成為FRET受體的潛力，有望成為優(yōu)秀的FRET。近幾年來使用mOrange作為熒光受體的研究越來越多，為研究細(xì)胞內(nèi)生物大分子相互作用以及探究生命過程提供有效工具。

Ke等通過將mOrange連接到哈氏弧菌熒光酶素α亞基的N端，從而使該融合蛋白獲得了新的560 nm的發(fā)射峰。這為通過將熒光素酶與其他合適的 FPs或發(fā)色團(tuán)共價結(jié)合來改變細(xì)菌的生物發(fā)光顏色提供思路[50]。De等開發(fā)一種結(jié)合mOrange和熒光酶素的自發(fā)光融合蛋白 (BRET3)，新的融合蛋白在光強(qiáng)上提升了幾倍，且能解決體內(nèi)熒光成像等相關(guān)問題[51]。這兩種應(yīng)用都是將熒光酶素與FPs結(jié)合使用，利用熒光酶素本身利用生物底物發(fā)光的性質(zhì)以及橙色 FPs的高消光系數(shù)和高量子產(chǎn)率的優(yōu)勢進(jìn)行創(chuàng)新的熒光標(biāo)記手段，具有巨大的應(yīng)用前景，可以為后人的實驗設(shè)計提供新的思路。

植物依靠肌動蛋白細(xì)胞骨架來驅(qū)動基本的細(xì)胞活動，這對它們的正常生長和發(fā)育至關(guān)重要，包括與細(xì)胞分裂、細(xì)胞膨脹和膜重構(gòu)等相關(guān)的生命活動[52]。Bayle等報道了在完整植物細(xì)胞中使用綠色FPs突變體TSapphire作為mOrange的熒光供體的應(yīng)用。嵌合連接的TSapphire和mOrange之間發(fā)生大量的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致 TSapphire熒光壽命縮短。并且驗證了該系統(tǒng)在不同的亞細(xì)胞中的通用性[49]。

視網(wǎng)膜鳥苷?；h(huán)化酶激活蛋白 (GCAPs)可以調(diào)節(jié)人類的視覺光反應(yīng)。Peshenko等對整個GCAP1蛋白表面殘基進(jìn)行誘導(dǎo)突變，并用mOrange標(biāo)記，在細(xì)胞基礎(chǔ)上測試每個突變體與GFP標(biāo)記的視網(wǎng)膜鳥苷?；h(huán)化酶的體外結(jié)合以及激活能力，從而探索GCAPs與其靶酶相互作用的關(guān)鍵位點[53]。研究發(fā)現(xiàn) Orai1蛋白以及 STIM1蛋白構(gòu)建的 Ca2+儲存通道在 Ca2+進(jìn)入及信號傳遞中發(fā)揮重要作用[54]。Huang等用EGFP標(biāo)記Orai1作為熒光供體，mOrange標(biāo)記STIM1作為熒光受體在大鼠神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，探索兩者之間的相互作用[55]。肌動蛋白細(xì)胞骨架參與多種生物過程，包括T細(xì)胞活化[56]。Larbret等將EGFP和mOrange分別融合到T細(xì)胞株的肌動蛋白上，當(dāng)游離的G肌動蛋白互相連接組成 F肌動蛋白時，靠近的EGFP和mOrange之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，從而觀測活細(xì)胞中G肌動蛋白和F肌動蛋白之間的動態(tài)平衡[57]。Goedhart等構(gòu)建mKO-mCherry FRET受體供體對，用于檢測活細(xì)胞中NF-kB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物亞族p65的同源二聚化，具有比CFP-YFP受體供體對更高的 FRET效率[1]。表明在單個活細(xì)胞中，基于紅色 FPs的 FRET方法更適合于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。

4 總結(jié)與展望

本文主要介紹了橙色FPs的研究和發(fā)展，以及其在蛋白標(biāo)記、FRET、生物傳感器等方面的運用。隨著對FPs晶體結(jié)構(gòu)研究的深入，人們大大提高了對于熒光發(fā)色團(tuán)的認(rèn)識。通過對一些優(yōu)秀突變體的結(jié)構(gòu)分析，我們了解了一些能夠引起FPs性質(zhì)改變的關(guān)鍵位點。結(jié)合目前現(xiàn)有的橙色 FPs以及待發(fā)現(xiàn)的野生型橙色 FPs，相信可以設(shè)計和研發(fā)出更多可應(yīng)用的突變體。現(xiàn)有的常規(guī)橙色FPs如mOrange、mKO具有較高的消光性質(zhì)和量子產(chǎn)率，在FRET中有巨大的應(yīng)用前景。除此之外還有很多創(chuàng)新的應(yīng)用，比如FPs與生物熒光酶素的融合表達(dá)也趨于流行，以及大斯托克位移的 FPs如CyOFP1在多熒光標(biāo)記中的應(yīng)用。有理由相信，橙色FPs將會與眾多FPs一起在未來的生物學(xué)研究中起到重要作用。