胡巧,史雨馨,楊曉玲,張靜,李波,廖曉玲,劉雪
1 重慶科技學(xué)院 納微復(fù)合材料與器件重慶市重點(diǎn)實驗室,重慶 401331
2 重慶科技學(xué)院 納微生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)重慶市工程實驗室,重慶 401331
神經(jīng)遞質(zhì)主要是指在神經(jīng)化學(xué)傳遞中完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定化學(xué)物質(zhì),促使肌體完成特定的生物學(xué)反應(yīng)[1]。測定腦神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化和空間分布,是探索人類感知和思維的基礎(chǔ),同時也是預(yù)防和診斷治療腦神經(jīng)疾病的基礎(chǔ)。但是由于人體是一個復(fù)雜的環(huán)境,內(nèi)源性成分干擾大[2],體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量少,往往在特定的神經(jīng)環(huán)路中處于不斷的更新變化和代謝的動態(tài)平衡中,且疾病的發(fā)生往往是多種神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的共同結(jié)果[3]。因而,對神經(jīng)遞質(zhì)的高時間和空間分辨率的可視化檢測一直是生物醫(yī)學(xué)分析的難點(diǎn)。
近年來光致發(fā)光的熒光蛋白和通過低分子物質(zhì)催化而發(fā)光的發(fā)光蛋白被廣泛地應(yīng)用于生物小分子的檢測中[4],基于熒光和發(fā)光蛋白發(fā)展起來的檢測方法相較于傳統(tǒng)的方法具有較高的時間和空間分辨率,有效解決了傳統(tǒng)分析方法不能實時檢測活細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)分布規(guī)律或不能反映神經(jīng)遞質(zhì)活性變化的弊端。開發(fā)針對神經(jīng)遞質(zhì)的生物探針一直是國際神經(jīng)科學(xué)上的重大課題,旨在復(fù)雜的生物體系中實現(xiàn)高時間和空間分辨率的檢測快速變化的特定神經(jīng)遞質(zhì)。這要求神經(jīng)遞質(zhì)探針設(shè)計時,選擇恰當(dāng)?shù)氖荏w蛋白和熒光蛋白,構(gòu)建具有高特異性、能精確反映神經(jīng)遞質(zhì)真實動態(tài)信息的生物傳感器。本文綜述近年來利用熒光和發(fā)光蛋白開發(fā)的可視化監(jiān)測技術(shù)和在不同神經(jīng)遞質(zhì)中的應(yīng)用情況,包括了具有較好研究基礎(chǔ)的谷氨酸 (Glutamic acid, Glu)和 γ-氨 基 丁 酸(γ-aminobutyric acid,GABA),以及近幾年新發(fā)展的多巴胺 (Dopamine,DA) 和乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh) 探針,歸納總結(jié)了不同方法的優(yōu)缺點(diǎn),并對未來神經(jīng)遞質(zhì)探針發(fā)展進(jìn)行了展望,為神經(jīng)遞質(zhì)的可視化監(jiān)測提供較為系統(tǒng)的參考。
目前神經(jīng)遞質(zhì)的體內(nèi)檢測技術(shù)主要分為3類。第一類經(jīng)典檢測技術(shù)是微透析,但是由于其采樣量大、采樣率低和時間分辨率低,使其不適用于復(fù)雜和快速演變的行為中檢測神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化[5]。第二類技術(shù)是快速掃描循環(huán)伏安法(Fast scan cyclic voltammetry,F(xiàn)SCV),F(xiàn)SCV 具有出色的時間分辨率 (亞秒級)、高靈敏度 (納摩爾級) 和空間分辨率 (微米級)。然而,F(xiàn)SCV 難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的神經(jīng)遞質(zhì),例如DA和去甲腎上腺素 (Norepinephrine,NE)[6]。此外,微透析和FSCV都需要將相對較大的探針 (直徑約為70–300 mm) 植入腦組織,這限制了對內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)釋放空間的精確測量[7]。第三類是隨著熒光蛋白和發(fā)光蛋白發(fā)展起來的各類神經(jīng)遞質(zhì)生物傳感器。這類生物傳感器具有更加優(yōu)良的時間和空間分辨率,可以實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域中的神經(jīng)遞質(zhì)快速釋放過程的可視化監(jiān)測,如細(xì)胞器(0–10 μm)、脂筏 (70 μm 左右) 等,是現(xiàn)階段最具研究價值的神經(jīng)遞質(zhì)監(jiān)測方法。目前,第三類檢測方法主要包含兩種較為成熟的技術(shù):基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (Fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET) 技術(shù)的生物傳感器和基于單熒光蛋白的生物傳感器。
近年來熒光技術(shù)發(fā)展迅速,基于FRET技術(shù)的神經(jīng)遞質(zhì)傳感器發(fā)展日趨成熟,因其可以實現(xiàn)活體、原位條件下信號分子的動態(tài)實時檢測而被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中,通過蛋白構(gòu)象改變(結(jié)合/解離) 誘導(dǎo)兩個熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光共振現(xiàn)象,不僅可以檢測神經(jīng)遞質(zhì)活性,還可以實現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間隙/細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)空間分布的可視化[8]。FRET生物傳感器的設(shè)計需要考慮兩個主要問題,首先是選擇恰當(dāng)?shù)母兄Y(jié)構(gòu)域,能對目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生特異性的生物反應(yīng),發(fā)生構(gòu)象的變化;其次是兩個熒光基團(tuán)FRET效率的變化必須足夠大,確保熒光強(qiáng)度比 Ia/Id的變化足夠明顯,便于相關(guān)成像設(shè)備檢測。與傳統(tǒng)的技術(shù)相比,基于FRET的神經(jīng)遞質(zhì)傳感器能夠在不損傷活細(xì)胞的前提下研究神經(jīng)遞質(zhì)在不同腦功能區(qū)的時空分布,可以高特異性地實現(xiàn)在視網(wǎng)膜切片、突觸間隙和活體等多個模型的長期穩(wěn)定成像,具有更加優(yōu)良的時間和空間分辨率。
單熒光探針也是實現(xiàn)可視化監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)的理想工具。比如,構(gòu)象敏感的綠色熒光蛋白的突變體 (Circularly permutated green fluorescent protein,cpGFP),它是由GFP序列前后置換改造而來,其熒光強(qiáng)度可由多肽鏈N端和C端不同的結(jié)合狀態(tài)而改變。探針蛋白與目標(biāo)神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后,由于構(gòu)象改變而引發(fā)cpGFP熒光強(qiáng)度的變化。與FRET探針相比,cpGFP探針的結(jié)構(gòu)更加簡單,單熒光記錄模式適用范圍更廣,特別適合于組織切片以及在體內(nèi)可視化檢測神經(jīng)遞質(zhì)釋放的時空規(guī)律。通過病毒轉(zhuǎn)染實現(xiàn)體內(nèi)表達(dá),記錄不同腦功能區(qū)中單個細(xì)胞的活動,甚至可以分辨單個樹突棘中的神經(jīng)活動。cpGFP作為熒光輸出模塊,具有熒光強(qiáng)度高、表達(dá)效率高和熒光穩(wěn)定好的優(yōu)勢,是構(gòu)建結(jié)構(gòu)更簡單的神經(jīng)遞質(zhì)傳感器的理想工具。典型代表包括了檢測Glu的iGluSnFR[9]、檢測 GABA的 iGABASnFR[10]、檢測 DA的GRABDA[11]和 dLight1[12],以及檢測 ACh的GACh[13]。
谷氨酸是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)[14],介導(dǎo)著復(fù)雜的信號傳遞,基本上影響所有形式的行為,精神分裂癥和帕金森等神經(jīng)類疾病的發(fā)生都是由于谷氨酸濃度和分布的變化而引發(fā)的[15]。經(jīng)過多年研究,谷氨酸探針已經(jīng)成為發(fā)展最為成熟且種類最多的神經(jīng)遞質(zhì)可視化監(jiān)測技術(shù)。
Okumoto等[16]通過將綠色熒光蛋白變體 FP附著到成熟天冬氨酸結(jié)合蛋白ybeJ (也稱為GltI)的每個末端構(gòu)建了初代谷氨酸納米傳感器FLIPE。谷氨酸結(jié)合會觸發(fā) GltI內(nèi)的構(gòu)象變化,從而使得cpGFP的去質(zhì)子化和熒光增強(qiáng)。FLIPE能夠靶向定位于亞細(xì)胞區(qū)室,可用于監(jiān)測活細(xì)胞表面的寬濃度范圍內(nèi)的谷氨酸濃度變化,適用于測量膠質(zhì)谷氨酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、可視化溢出效應(yīng)和生物體中神經(jīng)元活性等。在視網(wǎng)膜中,谷氨酸含量和分布的變化是導(dǎo)致糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變[17]、急性青光眼節(jié)細(xì)胞死亡等重要原因[18]。為了揭示谷氨酸在視網(wǎng)膜中釋放的時空變化規(guī)律與信息傳遞的關(guān)系,F(xiàn)irl等[19]創(chuàng)建了基于FRET的優(yōu)化谷氨酸傳感器 FLII81E-1μ。表達(dá)該探針蛋白并孵育視網(wǎng)膜切片,記錄到了突觸間隙中類似于鈣波的谷氨酸波,揭示了通過內(nèi)網(wǎng)狀層傳播的谷氨酸釋放的時空變化規(guī)律與信息傳遞的關(guān)系。
iGluSnFR[9]系列的生物傳感器也是實現(xiàn)可視化檢測谷氨酸的一種重要的技術(shù) (圖 1),iGluSnFR是一種由大腸桿菌GltI和cpGFP構(gòu)建的單波長Glu傳感器,突破性地實現(xiàn)了在完整組織中可視化谷氨酸釋放過程。iGluSnFR具有適合于體內(nèi)成像的信噪比和動力學(xué),可對原位谷氨酸特異性反應(yīng)。應(yīng)用iGluSnFR在樹突棘上觀察到了大而快速的Glu信號,測量了視網(wǎng)膜中雙極細(xì)胞的感受野,有效地實現(xiàn)了在體細(xì)胞、樹突、視網(wǎng)膜、蠕蟲、斑馬魚和老鼠中長期穩(wěn)定的成像。iGluSnFR具有高谷氨酸親和力和大的動態(tài)范圍,但目前的時間分辨率不適用于監(jiān)測突觸中谷氨酸快速釋放。因此,Helassa等[20]通過對連接子和結(jié)合親和力優(yōu)化,開發(fā)了兩個可快速檢測的iGluSnFR 變體 iGluf (用于“快速”) 和 iGluu (用于“超快速”),實現(xiàn)了在高頻傳輸過程中準(zhǔn)確跟蹤突觸中谷氨酸動態(tài),并精確調(diào)控同谷氨酸結(jié)合過程中產(chǎn)生熒光的明亮程度。與iGluSnFR相比,iGluf和iGluu在體外的構(gòu)象變化速度提升6倍,在突觸中的動力學(xué)速度提高了5倍,并且能夠直接報告100 Hz的離散突觸谷氨酸釋放事件。最近報道的紅色熒光的R-iGluSnFR1進(jìn)一步擴(kuò)展了谷氨酸傳感器的顏色[21]。
Masharina團(tuán)隊[22]基于 FRET技術(shù)研發(fā)的半合成熒光傳感器蛋白 (Snifits) 在神經(jīng)遞質(zhì)的檢測中也占據(jù)著重要的地位。Snifits是由SNAP-tag[23]、CLIP-tag[24]和分析物結(jié)合蛋白組成的融合蛋白 (圖 2)。Snifit利用天然受體-拮抗劑對,為細(xì)胞表面熒光代謝物傳感器的設(shè)計提供了思路。例如,基于離子型谷氨酸受體5 (iGluR5) 設(shè)計的針對Glu的傳感器Snifit-iGluR5。Snifit-iGluR5能在HEK 293細(xì)胞表面顯示對Glu最大的熒光比率變化為 1.56,高于任何其他現(xiàn)有的谷氨酸生物傳感器。此外,Snifit-iGluR5在細(xì)胞表面上用遠(yuǎn)紅色熒光基團(tuán)進(jìn)行的專有標(biāo)記將有助于在組織樣品上或體內(nèi)應(yīng)用以及與其他生物傳感器組合使用,進(jìn)一步優(yōu)化和表征將允許原位檢測Glu的生理水平。
圖1 iGluSnFR結(jié)構(gòu)示意圖[9]Fig. 1 iGluSnFR structure diagram[9].
圖2 Snifit-iGluR5結(jié)構(gòu)示意圖[22]Fig. 2 Snifit-iGluR5 structure diagram[22].
GABA是抑制性神經(jīng)遞質(zhì),調(diào)控多種神經(jīng)疾病,如癲癇[25]、焦慮癥和精神分裂癥[26]。GABA功能的詳細(xì)表征需要以高時間和空間分辨率測量其濃度。目前GABA探針已有一定基礎(chǔ),但結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,應(yīng)用仍不夠廣泛。
基于FRET的熒光生物傳感器非常適合測量體內(nèi)的小分子濃度。Masharina等[27]利用Snifit構(gòu)建了第一個用于測量活細(xì)胞表面GABA濃度的熒光比率傳感器GABA-Snifit (圖3),可以在活哺乳動物細(xì)胞的表面上以高特異性和時空分辨率檢測GABA。當(dāng)在細(xì)胞表面組裝時,GABA-Snifit允許感測微摩爾至毫摩爾GABA濃度。此外,可以使用GABA-Snifit來定量GABAB受體激動劑、拮抗劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的作用的相對結(jié)合親和力。GABA-Snifit是研究GABA和GABAB受體在生物系統(tǒng)中功能的有價值的工具。然而,它在神經(jīng)元系統(tǒng)中的效用是有限的,添加兩個單獨(dú)的小分子使傳感器的結(jié)構(gòu)復(fù)雜化,并且其對GABA的親和力非常弱 (約400 μmol/L)。此外,GABA受體的過表達(dá)可能破壞細(xì)胞信號傳導(dǎo),GABA受體的異源寡聚化可能降低傳感器功能。
圖3 GABA-Snifit結(jié)構(gòu)示意圖[27]Fig. 3 GABA-Snifit structure diagram[27].
Marvin等[10]基于谷氨酸受體 iGluSnFR的原理,開發(fā)出可檢測 GABA濃度的熒光探針iGABASnFR。實現(xiàn)了對培養(yǎng)神經(jīng)元和急性小鼠腦切片中GABA釋放效用的觀測。應(yīng)用iGABASnFR追蹤了線粒體中GABA含量,在體內(nèi)觀察到小鼠視皮層中的大量GABA瞬變,并利用癲癇模型進(jìn)一步檢測iGABASnFR的可行性。最后,在斑馬魚中,利用iGABASnFR將小腦中的GABA能信號與運(yùn)動輸出相關(guān)聯(lián)。iGABASnFR具有現(xiàn)有GABA傳感器中最佳的性能,是唯一適合體內(nèi)使用的GABA傳感器。未來的iGABASnFR將向著可控的親和力、動力學(xué)和更優(yōu)的信噪比發(fā)展。
針對以上GABA探針結(jié)構(gòu)較復(fù)雜且需一定時間等待基因表達(dá)的問題。Hu等[28]在GABAB受體的胞外區(qū)兩端連接熒光蛋白,構(gòu)建了基于 FRET的GABA探針FGB1-VFT。在體外表達(dá)該探針蛋白并孵育腦片,可實現(xiàn)對神經(jīng)組織中突觸釋放的快速檢測。
DA是非常重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),參與調(diào)節(jié)廣泛的復(fù)雜過程,包括獎勵信號[29]、感知學(xué)習(xí)、注意力的變化和運(yùn)動控制[30]。在人腦中,DA的傳播和受損同多種神經(jīng)類疾病有著緊密的聯(lián)系,如精神分裂癥[31]和帕金森[32]。
CNiFERs[33]可以測量通過 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs) 發(fā)出信號的任何神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,且具有天然GPCR的特性,保留了內(nèi)源表達(dá)受體的化學(xué)特異性、親和力和時間動力學(xué)。迄今為止,利用CNiFERs已經(jīng)實現(xiàn)了對體內(nèi) ACh、DA和 NE的檢測。Muller等[34]創(chuàng)建的檢測DA的CNiFERs (圖4),它具有納摩爾的高靈敏度、秒的時間分辨率以及較寬的動態(tài)范圍,并且對大腦的影響較小。目前,已有報道利用 CNiFERs傳感器研究學(xué)習(xí)期間腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA釋放過程的動力學(xué),并將CNiFERs移植到小鼠額葉皮層內(nèi),得到小鼠學(xué)習(xí)與獎勵時,神經(jīng)信號的變化。CNiFERs傳感器為研究DA在神經(jīng)系統(tǒng)中更復(fù)雜的行為提供了更高的時間和空間分辨率。
圖4 CNiFERs結(jié)構(gòu)示意圖[33]Fig. 4 CNiFERs structure diagram[33].
dLight1[12]在急性腦切片和行為期間小鼠中能進(jìn)行動態(tài)的高分辨率成像,亞微摩爾親和力和快速動力學(xué)造就了高時間分辨率,能夠長期跟蹤監(jiān)測由學(xué)習(xí)引起的紋狀體中DA毫秒級的變化情況。
GRABDA[11]將cpGFP作為熒光輸出模塊偶聯(lián)到神經(jīng)遞質(zhì)受體上,構(gòu)建受體-cpGFP嵌合體,隨后通過突變、篩選和表征得到性能優(yōu)異的神經(jīng)遞質(zhì)傳感器 (圖 5)。GRABDA能夠在離體和體內(nèi)的多個模型系統(tǒng)中,對內(nèi)源性DA動態(tài)進(jìn)行特異性的實時檢測。與現(xiàn)有的檢測方法相比,GRABDA具有更高的靈敏度,較大的表觀親和力,優(yōu)異的膜運(yùn)輸性;相對較小的基因編碼區(qū),可適用于轉(zhuǎn)基因和病毒包裝;對DA具有高度特異性;具有快速響應(yīng)動力學(xué),適合快速檢測神經(jīng)遞質(zhì)的釋放情況。
ACh介導(dǎo)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞間通訊。ACh釋放含量和分布同注意力、感知力、聯(lián)想學(xué)習(xí)和睡眠/清醒平衡[35]都有密切關(guān)系。CNiFERs傳感器也可以實現(xiàn)對 ACh的檢測[33],CNiFER直接植入大腦,能夠以小于100 μm的空間分辨率感知神經(jīng)遞質(zhì)ACh釋放。
Jing[13]通過將cpGFP耦合到毒蕈堿型ACh受體 (Muscarinic receptor,MR) 中構(gòu)建一種更加用戶友好、廣泛適用的GACh傳感器 (圖6)。利用病毒或者遺傳學(xué)手段轉(zhuǎn)染ACh給十幾種不同動物來源的神經(jīng)元及非神經(jīng)元細(xì)胞,從而驗證了GACh傳感器的性能。GACh傳感器具有高靈敏度、信噪比、對細(xì)胞生理學(xué)干擾小和強(qiáng)的光穩(wěn)定性,適用于監(jiān)測體外、離體和體內(nèi)不同組織中的膽堿能信號。
圖5 GRABDA結(jié)構(gòu)示意圖[11]Fig. 5 GRABDA structure diagram[11].
圖6 GACh結(jié)構(gòu)示意圖[13]Fig. 6 GACh structure diagram[13].
神經(jīng)遞質(zhì)釋放是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中信息處理的核心部分,在神經(jīng)科學(xué)的研究中神經(jīng)遞質(zhì)濃度的時間和空間變化可視化是完全理解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工作原理的必要部分。神經(jīng)遞質(zhì)的可視化檢測一直是科學(xué)研究中的一大難題,主要是由于:第一,在神經(jīng)系統(tǒng)中存在化學(xué)或結(jié)構(gòu)同神經(jīng)遞質(zhì)類似的物質(zhì),這會對檢測的特異性、準(zhǔn)確性造成干擾;第二,神經(jīng)遞質(zhì)在人體中濃度較小且處于不更新變化和代謝的動態(tài)平衡中,想要實時觀察神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程就要求檢測工具具有足夠高的時間和空間分辨率,較強(qiáng)的熒光比率;第三,如果是針對某一特定區(qū)域監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化情況,還要求監(jiān)測工具具有一定的靶向性,以特異性分析特定位置神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化情況;第四,對神經(jīng)遞質(zhì)的研究一般是針對單細(xì)胞/突觸水平以及神經(jīng)元或體內(nèi)小網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)遞質(zhì)釋放規(guī)律,這就要求監(jiān)測工具的結(jié)構(gòu)/體積盡量不要太復(fù)雜/大。
要實現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)的可視化,還需在以下幾個方面進(jìn)行努力。首先,選擇恰當(dāng)?shù)母袘?yīng)模塊和熒光報告模塊成為提高神經(jīng)遞質(zhì)傳感器特異性和簡化傳感器結(jié)構(gòu)/體積的關(guān)鍵;其次,提高傳感器的分辨率和動態(tài)響應(yīng)范圍,一方面可以通過改造發(fā)色團(tuán)偶極取向,另一方面可以通過突變發(fā)色團(tuán)附近的氨基酸殘基,篩選特異性更好、靈敏度更高和動態(tài)響應(yīng)范圍更大的發(fā)色基團(tuán)[36];最后,利用遺傳編碼等技術(shù)持續(xù)開發(fā)更多的檢測工具,尋找更優(yōu)的熒光和發(fā)光蛋白都將為神經(jīng)遞質(zhì)的可視化帶來突破性進(jìn)展。
在過去二十年里,各類熒光探針的開發(fā)所取得的成果為未來實現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)的可視化監(jiān)測奠定了堅實的基礎(chǔ)。其中DA和ACh兩種神經(jīng)遞質(zhì)的受體為單亞基結(jié)構(gòu),近年來基于 cpGFP的熒光探針發(fā)展逐漸成熟,使二者的探針可以用于體外、體內(nèi)等不同組織[11,13,37]。而 Glu和 GABA的探針雖然發(fā)展時間較長且種類較多,但由于其受體的雙亞基結(jié)構(gòu),所開發(fā)出的探針往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜,以體外應(yīng)用為主。作為神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的兩類神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA的檢測仍需要更有效的探針。神經(jīng)遞質(zhì)可視化生物傳感器各具特色,在不同的性能指標(biāo)上具有一定的差異 (表1),合理的選擇和優(yōu)化檢測工具將推進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)傳感器解決更多的現(xiàn)實問題。除以上神經(jīng)遞質(zhì)外,其他神經(jīng)遞質(zhì)的可視化工具也值得進(jìn)一步研究,現(xiàn)有的神經(jīng)遞質(zhì)探針多以受體為目標(biāo)進(jìn)行改造,限制了探針的空間移動性。Ca2+探針是神經(jīng)影像學(xué)中廣泛使用的工具,借鑒 Ca2+探針的理念,熒光探針進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi),和細(xì)胞內(nèi)的酶發(fā)生反應(yīng),生成裝載細(xì)胞內(nèi)的生物探針。這類神經(jīng)遞質(zhì)探針不受細(xì)胞膜的空間限制,將突破性地提高神經(jīng)遞質(zhì)探針的應(yīng)用范圍。
另一方面,對神經(jīng)遞質(zhì)可視化檢測技術(shù)的研究可以以需求為導(dǎo)向,利用神經(jīng)系統(tǒng)中的經(jīng)典模型或者久未解決的問題推動研究工作的開展。比如在視網(wǎng)膜的外網(wǎng)狀層中,GABA是否參與了負(fù)反饋調(diào)節(jié)一直是爭論的焦點(diǎn)[38]。當(dāng)免疫熒光、電生理等傳統(tǒng)技術(shù)都無法解決這一問題時,尋找合適的GABA釋放實時可視化監(jiān)測技術(shù)可能是解決問題的關(guān)鍵。
除了為不同的神經(jīng)遞質(zhì)開發(fā)新的可視化監(jiān)測技術(shù)外,生物發(fā)光技術(shù)的不斷進(jìn)步也引發(fā)了用于腦成像的生物發(fā)光傳感器的革命。相關(guān)研究通過將現(xiàn)有的基于FRET的生物傳感器中的供體與熒光素酶交換,開發(fā)了新的基于生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (Bioluminescent resonance energy transfer,BRET) 的生物傳感器。特別是用NanoLuc替代FRET傳感器中的CFP使得BRET傳感器具有良好的靈敏度和響應(yīng)幅度。由于大多數(shù)基于FRET的生物傳感器是模塊化的,因此該方法原則上可適用于開發(fā)各種生物分子或功能的BRET生物傳感器。目前,已經(jīng)開發(fā)了針對ATP[39]、膜電壓[40]和Zn2+[41]的BRET傳感器。未來將基于BRET的生物傳感器引入對神經(jīng)遞質(zhì)的可視化監(jiān)測是必然的趨勢。此外,可以將螢光素酶 (例如NanoLuc和teLuc) 直接插入適當(dāng)?shù)母兄Y(jié)構(gòu)域中,以得到高熒光強(qiáng)度的生物傳感器。
表1 可視化神經(jīng)遞質(zhì)傳感器性能指標(biāo)列表Table 1 A list of neurotransmitter sensor performance indicators
各類熒光探針的發(fā)展還同相關(guān)的光學(xué)儀器和成像數(shù)據(jù)處理技術(shù)有著緊密的聯(lián)系,近年來多光子成像[42]、數(shù)字光片顯微鏡[43]、像差校正多焦點(diǎn)顯微鏡[44]和空間光調(diào)制器顯微鏡[45]的發(fā)展將為各類熒光探針的發(fā)展提供保障??偟膩碚f,神經(jīng)遞質(zhì)的可視化研究已經(jīng)具備較好的基礎(chǔ),未來的神經(jīng)遞質(zhì)檢測技術(shù)必然向著無創(chuàng)、定量特異、信號增強(qiáng)和實時可視化發(fā)展,具有更高時間和空間分辨率的神經(jīng)遞質(zhì)檢測工具在神經(jīng)生物學(xué)中將有十分良好的應(yīng)用前景。