哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)與優(yōu)化

張瓊瓊，方明月，栗軍杰，曹榮月

1 中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 211100

2 上海藥明生物技術(shù)有限公司 細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)部，上海 200131

生物藥靶向性高、療效好、毒副作用小，自20世紀(jì)80年代一經(jīng)提出，便備受醫(yī)患人員的青睞。近年來生物藥占據(jù)的市場(chǎng)份額發(fā)展更為迅猛，僅單克隆抗體便占去2017年年度十大暢銷藥中的8個(gè)名額，且年度銷售額高達(dá)1 230億美元[1]。

與微生物及昆蟲細(xì)胞相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有翻譯后修飾功能，在蛋白類藥物表達(dá)方面展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通常是生物藥物生產(chǎn)的首選平臺(tái)。隨著近年來市場(chǎng)上對(duì)生物藥物需求量的持續(xù)增長(zhǎng)，生物藥物收益大幅度提升，更是在全球范圍內(nèi)掀起了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的熱潮[2]。目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株主要有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese hamster ovary,CHO)、倉(cāng)鼠胚腎細(xì)胞 (Baby hamster kidney,BHK)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (NS0和 SP2/0)，還有一些人類細(xì)胞株，包括HEK293和HT-2080。其中對(duì)CHO細(xì)胞株的研究最為充分，應(yīng)用最為廣泛[3]。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的開發(fā)及優(yōu)化也主要針對(duì)CHO細(xì)胞株展開論述。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)較之傳統(tǒng)的微生物細(xì)胞培養(yǎng)難度較大[4]，主要是由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)、代謝途徑復(fù)雜、對(duì)外界環(huán)境敏感性強(qiáng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，且培養(yǎng)過程中細(xì)胞狀態(tài)容易改變。目前常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝有：批次培養(yǎng)、補(bǔ)料批次培養(yǎng)和灌流培養(yǎng) (圖1)。

目前常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝特點(diǎn)見表1。

圖1 目前常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝示意圖Fig. 1 Schematic diagram of mammalian cell culture process commonly used at present. (A) Batch. (B) Fed-Batch. (C)Perfusion.

表1 常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝特點(diǎn)[5-10]Table 1 Characteristics of mammalian cell culture process[5-10]

基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)在產(chǎn)物產(chǎn)量、質(zhì)量及成本等方面表現(xiàn)出來的顯著優(yōu)勢(shì)，越來越多獲批上市的生物藥物使用灌流培養(yǎng)工藝進(jìn)行生產(chǎn)[11]，對(duì)灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)和優(yōu)化進(jìn)而成為當(dāng)前哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究的熱點(diǎn)[12]。結(jié)合圖1和表1可以看出較之傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)工藝存在的特有之處及工藝優(yōu)化應(yīng)著重關(guān)注的地方有：① 灌流新鮮培養(yǎng)基，灌流速率的大小調(diào)節(jié)；② 放流多余細(xì)胞，放流速率的大小調(diào)節(jié)；③ 灌流工藝培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，細(xì)胞活率的維持和產(chǎn)量的提高；④ 細(xì)胞截留裝置，細(xì)胞的高效截留和產(chǎn)物的高效濾過。本文主要從以上幾個(gè)方面展開綜述，以期為工業(yè)懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)提供參考。

1 細(xì)胞比灌流速率 (Cell specific perfusion rate，CSPR)

CSPR指單位細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)灌流到的新鮮培養(yǎng)基體積，其相應(yīng)的計(jì)算公式為：

式中，CSPR：細(xì)胞比灌流速率 (pL/(cell·d))；PR：perfusion rate，灌流速率 (vvd, L/(L·d))；VCD：viable cell density，活細(xì)胞密度 (106cells/mL)。

CSPR代表了培養(yǎng)過程中每天給到每個(gè)細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基體積，反映了灌流提供給細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)水平，并不代表細(xì)胞自身的代謝狀態(tài)。CSPR作為連接PR和VCD的橋梁，在灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)和優(yōu)化過程中具有較高的指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)其優(yōu)化的方向是盡可能降低CSPR值的大小。這主要出于兩方面的考慮[13]：① 減少新鮮培養(yǎng)基的供應(yīng)，降低生產(chǎn)成本 (包括培養(yǎng)基自身及存儲(chǔ)設(shè)備的成本)；②降低收獲液總體積，同時(shí)提高收獲液中目的產(chǎn)物濃度，減輕下游純化壓力[14]?；谶@兩點(diǎn)考慮，Konstantinov等[15]建議應(yīng)將CSPR盡可能控至低于50 pL/(cell·d)。

結(jié)合CSPR的定義，對(duì)其優(yōu)化的方法主要有兩大類：① 降低PR；② 提高目標(biāo)VCD。但在實(shí)際操作過程中，各參數(shù)并不是可以無限調(diào)節(jié)的，應(yīng)綜合考慮其對(duì)培養(yǎng)過程的影響。PR過低則：a) 不足以供給細(xì)胞生長(zhǎng)最低的營(yíng)養(yǎng)需求和及時(shí)帶走代謝廢物，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受限、活率下降；b) 目的產(chǎn)物在反應(yīng)罐中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，有降解風(fēng)險(xiǎn) (尤其是不穩(wěn)定的產(chǎn)物，如FVIII[16])。PR過高則：a) 細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基養(yǎng)分利用不充分，造成原料的浪費(fèi)，提高生產(chǎn)成本；b) 收獲液目的產(chǎn)物濃度較低，下游純化壓力較大。VCD過低則：該培養(yǎng)體系的時(shí)空產(chǎn)率較低 (Space-time yield，STY，g/(L·d))，生產(chǎn)成本高；VCD過高則：培養(yǎng)液粘度過高，細(xì)胞截留裝置及供氧等設(shè)備不足以維持工藝正常運(yùn)行[17]。

降低CSPR的相關(guān)方法在文獻(xiàn)中有諸多報(bào)道。其中Konstantinov等[15]提出了“push-to-low”策略，該策略指在灌流培養(yǎng)的穩(wěn)定階段通過調(diào)節(jié) PR或VCD來逐步降低CSPR，直到尋找到CSPR的最小值，具體表現(xiàn)為更低的CSPR將導(dǎo)致細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 (μ)、存活率 (Viability) 及比生產(chǎn)速率 (Qp) 等的下降。Lin等[18]在對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行濃縮優(yōu)化的基礎(chǔ)上結(jié)合“push-to-low”的策略，為其所培養(yǎng)的CHO細(xì)胞株鎖定到了最小的CSPR為75 pL/(cell·d)，并將其成功放大至100 L的生產(chǎn)規(guī)模。Hiller等[14]在CHO細(xì)胞生長(zhǎng)階段將灌流泵關(guān)聯(lián)于 pH控制上，細(xì)胞在缺乏碳源情況下消耗乳酸使pH升高從而觸發(fā)灌流的運(yùn)行，提出了細(xì)胞按營(yíng)養(yǎng)需求自主調(diào)控PR的灌流策略，整個(gè)灌流過程將CSPR成功控制于 20–40 pL/(cell·d) 之間。Gagnon 等[19]則提出在前期CHO細(xì)胞生長(zhǎng)階段使用相對(duì)較高的CSPR，促使細(xì)胞快速生長(zhǎng)至目標(biāo) VCD，隨之切換為濃縮的培養(yǎng)基以較低的CSPR繼續(xù)灌流培養(yǎng)，這一策略減少了培養(yǎng)基的總用量并且方便了下游對(duì)目的產(chǎn)物的連續(xù)收獲及純化。

2 放流速率 (Bleeding rate) 調(diào)節(jié)

灌流培養(yǎng)工藝較傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)工藝，最顯著的特點(diǎn)是為細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定且有利的生長(zhǎng)環(huán)境，這主要得益于在培養(yǎng)過程中維持各個(gè)培養(yǎng)參數(shù)的穩(wěn)定，這些參數(shù)主要包括各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度及細(xì)胞密度。其中恒定細(xì)胞密度的維持需要結(jié)合細(xì)胞的生長(zhǎng)速率適當(dāng)放流掉一定數(shù)量的細(xì)胞，在灌流培養(yǎng)的穩(wěn)定階段放流速率 (數(shù)值上等于稀釋速率，Dilution rate，D) 應(yīng)等于細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率。細(xì)胞生長(zhǎng)越快，則需要放流的培養(yǎng)液量也越多，隨之帶來的問題是目的產(chǎn)物隨著放流液的流失，導(dǎo)致產(chǎn)物收率降低[5]。因此，在灌流培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定階段，一方面需要維持細(xì)胞密度足夠高以確保較高的目的產(chǎn)物時(shí)空產(chǎn)率，另一方面也應(yīng)當(dāng)朝著降低放流速率的方向優(yōu)化，進(jìn)一步提高產(chǎn)物收率，比較理想的放流速率應(yīng)控制為占總灌流速率的5%–10%[20]。

降低放流速率的基本原則是通過營(yíng)養(yǎng)限制或環(huán)境限制為細(xì)胞提供次優(yōu)的生長(zhǎng)條件，以降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率[5]。通常將細(xì)胞分裂滯留于 G0/G1期，該階段為細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備時(shí)間，細(xì)胞代謝旺盛，包括目的產(chǎn)物的合成[21]。Park等[22]從一系列化學(xué)物質(zhì)中篩選出戊酸在抑制CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、提高細(xì)胞比生產(chǎn)速率上最具有優(yōu)勢(shì)。Wolf等[20]則對(duì)比了戊酸與降低培養(yǎng)溫度對(duì) CHO細(xì)胞表現(xiàn)的影響，并發(fā)現(xiàn)在加入1 mmol/L戊酸的實(shí)驗(yàn)條件下，CHO細(xì)胞先是較對(duì)照組 (36.5 ℃，不添加戊酸)表現(xiàn)出了更低的生長(zhǎng)速率，但在培養(yǎng)第8天以后，細(xì)胞生長(zhǎng)速率又逐漸回升。而較低培養(yǎng)溫度(33.0 ℃) 的實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)速率都維持在較低水平，顯著降低了細(xì)胞的放流速率，較對(duì)照組提升了目的蛋白收率高達(dá) 15%。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度確實(shí)是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、提高細(xì)胞比生產(chǎn)速率的常用方法，但針對(duì)不同的克隆，其最適的降溫后培養(yǎng)溫度并不完全一樣，因此在實(shí)際生產(chǎn)中還需結(jié)合實(shí)際情況尋找較為合適的培養(yǎng)溫度。

隨著灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)，近年來也發(fā)展起濃縮補(bǔ)料批次培養(yǎng) (Concentrated fed-batch，CFB)[23]的新型培養(yǎng)方式，其在連續(xù)培養(yǎng)過程中不控制穩(wěn)態(tài)環(huán)境，無需放流，通過提高工藝過程中的峰值VCD(Peak VCD)和 IVCD (Integrated viable cell density)，進(jìn)而在短時(shí)間內(nèi)獲得了極高的目的產(chǎn)物產(chǎn)量。較傳統(tǒng)的灌流培養(yǎng)工藝，該類新型工藝培養(yǎng)周期較短，但時(shí)空產(chǎn)率得到了顯著提升，在成本節(jié)約上具有顯著優(yōu)勢(shì)，有望在生物藥物生產(chǎn)中推廣使用。

3 細(xì)胞比生產(chǎn)速率 (Cell specific production rate，Qp) 的提高

提高培養(yǎng)體系的時(shí)空產(chǎn)率、降低藥物生產(chǎn)成本，是細(xì)胞培養(yǎng)研究人員一以貫之的目標(biāo)。決定高的時(shí)空產(chǎn)率的主要因素有[24]：高的細(xì)胞密度；高的 Qp；長(zhǎng)的可培養(yǎng)周期 (往往取決于高細(xì)胞密度情況下高細(xì)胞活率的維持)。相應(yīng)的，從細(xì)胞株自身出發(fā)，可以通過細(xì)胞構(gòu)建和克隆篩選獲得生長(zhǎng)優(yōu)異、代謝優(yōu)良、產(chǎn)量可觀的細(xì)胞株作為生產(chǎn)用細(xì)胞株。從細(xì)胞培養(yǎng)工藝出發(fā)，則可以針對(duì)不同的克隆篩選出最適宜的培養(yǎng)基，同時(shí)在培養(yǎng)過程中做好參數(shù)控制和調(diào)節(jié)，如溫度、溶氧、pH等。

傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)過程中，常在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)晚期適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度以促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)能的提升，Wolf等[20]采用CHO細(xì)胞株，在灌流工藝中同樣嘗試在目標(biāo)細(xì)胞密度下為細(xì)胞提供較低的培養(yǎng)溫度(33.0 ℃)，發(fā)現(xiàn)較培養(yǎng)溫度為36.5 ℃的條件，細(xì)胞Qp得到顯著提升。Qin等[25]在CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)的穩(wěn)定階段使用氯化鈉提高培養(yǎng)體系的滲透壓，成功提高了培養(yǎng)體系時(shí)空產(chǎn)率，并且降低了產(chǎn)物的多聚體和酸性電荷異質(zhì)體。Kuiper等[13]對(duì)現(xiàn)有用于補(bǔ)料批次培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和一定比例的補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行搭配混合，使用批次培養(yǎng)的搖管模型進(jìn)行初步篩選，并在1 L生物反應(yīng)器的規(guī)模下，使用灌流工藝培養(yǎng)CHO細(xì)胞，對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)合適比例的混合培養(yǎng)基能夠在灌流培養(yǎng)中獲得高的細(xì)胞密度及高的目的產(chǎn)物產(chǎn)量。

4 細(xì)胞截留裝置

4.1 細(xì)胞截留裝置簡(jiǎn)介

為了保證灌流過程中目的產(chǎn)物及時(shí)收獲的同時(shí)不造成所培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的損失，細(xì)胞截留裝置自然成為了必不可少的基本要素之一。隨著哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞截留設(shè)備也同樣經(jīng)歷著不斷的變革與創(chuàng)新，這其中不變的宗旨是在對(duì)細(xì)胞損傷較小的情況下，有效地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的截留和目的產(chǎn)物的濾過，這也是灌流工藝開發(fā)的重點(diǎn)所在。

目前常用的細(xì)胞截留技術(shù)及各自優(yōu)缺點(diǎn)列于表2。

相比之下，基于中空纖維柱過濾原理而設(shè)計(jì)的截留裝置，因其對(duì)細(xì)胞截留率高、支持培養(yǎng)細(xì)胞密度高且設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便及易于放大等優(yōu)點(diǎn)，在目前動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)中使用最為廣泛。目前常用的基于中空纖維柱過濾原理而開發(fā)的細(xì)胞截留裝置主要有切向流過濾 (Tangential flow filtration，TFF) 模式和交替式切向流 (Alternating tangential flow，ATF) 模式。相比于TFF，ATF用隔膜泵代替蠕動(dòng)泵，減少了系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的剪切力，同時(shí)由于隔膜泵周期性的凹凸運(yùn)動(dòng)，使得培養(yǎng)液在中空纖維柱中交替往復(fù)流動(dòng)，由此產(chǎn)生的反向沖刷作用一定程度上減慢了柱子堵塞的速度[30-32]，因此在灌流培養(yǎng)工藝中ATF更受青睞。

4.2 中空纖維柱濾膜堵塞問題研究進(jìn)展

由于灌流工藝較高的細(xì)胞密度和較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，收獲過程中往往會(huì)觀測(cè)到中空纖維柱濾膜堵塞 (Retention，R) 的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為目的產(chǎn)物在罐內(nèi)累積而收獲液中目的產(chǎn)物濃度降低。相應(yīng)的，中空纖維柱在t時(shí)刻堵塞程度可以表示為：

式中，R為中空纖維柱濾膜堵塞程度(%)；Titerbioreactor為t時(shí)刻罐內(nèi)蛋白產(chǎn)物濃度(mg/L)；Titerharvest為t時(shí)刻罐內(nèi)蛋白產(chǎn)物濃度(mg/L)。

在培養(yǎng)過程中，濾膜堵塞為不可逆的過程，隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，柱子對(duì)目的產(chǎn)物的截留漸趨嚴(yán)重，并最終因過低的目的產(chǎn)物收率及難以維持的收獲液流速而不得不更換柱子或終止培養(yǎng)[33-34]。濾膜堵塞相應(yīng)帶來的問題有：① 目的產(chǎn)物收率降低，增加生產(chǎn)成本[35]；② 目的產(chǎn)物截留于罐內(nèi)時(shí)間過久，影響產(chǎn)物質(zhì)量；③ 更換柱子增加操作的復(fù)雜性及染菌風(fēng)險(xiǎn)?；谶@些考慮，分析培養(yǎng)過程中引起濾膜堵塞的因素，并進(jìn)一步尋找可以減緩濾膜堵塞速率的措施是研究相關(guān)問題的主要方向。

4.2.1 中空纖維柱濾膜堵塞機(jī)理

目前業(yè)界普遍接受的濾膜使用過程中堵塞模型主要有4種[31,33]，分別為：(A) 濾孔口完全堵塞；(B) 濾孔口部分堵塞；(C) 濾孔內(nèi)部黏附微粒；(D) 濾膜表面形成濾餅 (圖2)。

表2 目前常用細(xì)胞截留技術(shù)及優(yōu)缺點(diǎn)[26-29]Table 2 Comparison of commonly used cell retention devices[26-29]

圖2 濾膜使用過程中堵塞模型圖Fig. 2 Diagram of filter membrane fouling. (A) Complete pore blockage. (B) Partial pore blockage. (C) Pore constriction. (D) Cake formation.

圖2中最右側(cè)部分代表中空纖維柱濾膜的縱切面，其中A、B兩種模型代表直徑大于濾膜孔徑的微粒的堵塞作用，主要有細(xì)胞及消泡劑聚集而形成的微球，降低了濾膜的有效過濾面積；C類模型代表直徑小于濾膜孔徑的微粒的堵塞作用，主要有細(xì)胞碎片、脂質(zhì)分子和細(xì)胞裂解釋放的核酸及胞內(nèi)蛋白等微粒黏附于濾膜孔徑內(nèi)壁，減小了濾孔有效過濾直徑，使得過濾阻力增加；D類模型則代表各種微粒在濾孔堵塞后而于濾膜表面堆積，形成一層餅狀黏附物，增大了過濾阻力，減小過濾流量。在實(shí)際培養(yǎng)過程中，4種基本的濾膜堵塞模型常常相伴存在。Hadpe等[31]針對(duì)這4種堵塞模型分別建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)計(jì)算模型，該數(shù)學(xué)模型認(rèn)為不同堵塞模型貢獻(xiàn)的過濾阻力大小依次為A>C>B>D，并進(jìn)一步指出濾孔的徹底堵塞是決定中空纖維柱在一輪實(shí)驗(yàn)中使用壽命的首要因素。Kelly等[33]也指出濾液及其中的微粒物質(zhì)優(yōu)先選擇通過阻力最小的濾孔，而不是堆積在已經(jīng)黏附于濾膜表面的顆粒上層形成濾餅。

4.2.2 影響中空纖維柱濾膜堵塞因素

影響濾膜堵塞的因素可以概括分為兩大類：①生物方面，主要指培養(yǎng)過程產(chǎn)生的可以引起濾膜堵塞的微粒物質(zhì)，如細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、消泡劑添加量、目的產(chǎn)物濃度及培養(yǎng)基組成等。灌流培養(yǎng)工藝常為高細(xì)胞密度發(fā)酵，往往需要開啟微泡提高氧傳質(zhì)效率，由此也給細(xì)胞帶來較高的剪切力，Xu等[36]認(rèn)為在CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)中，2 g/L的PF68已不足以保護(hù)細(xì)胞免受高剪切力的損傷，并通過對(duì)比5 g/L PF68對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度PF68可以更好地維持CHO細(xì)胞活率并由此降低了濾膜堵塞速率。Kelly等[33]通過采用 CHO細(xì)胞株展開實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了相同細(xì)胞活率、不同細(xì)胞密度的培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)在相同收獲液過濾速度的情況下，高細(xì)胞密度培養(yǎng)液傾向于形成更高的跨膜壓力和濾膜堵塞速率。且通過電鏡掃描濾膜切面，發(fā)現(xiàn)黏附于濾膜內(nèi)表面的主要為細(xì)胞碎片及消泡劑微球。Liew等[37]也指出由于消泡劑強(qiáng)的表面活性，使其很容易黏附于濾膜表面，而其高度不穩(wěn)定性也導(dǎo)致消泡劑碎片會(huì)黏附于濾孔內(nèi)壁，進(jìn)一步支持了消泡劑堵塞濾膜的觀點(diǎn)。Wang等[32]在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中通過測(cè)量乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase，LDH) 表征死細(xì)胞數(shù)量，指出較低的細(xì)胞活率導(dǎo)致較快的濾膜堵塞速率，并認(rèn)為主要的原因是由于細(xì)胞死亡后裂解釋放大量直徑介于 10–100 nm的微粒，此類微粒很快會(huì)引起濾膜堵塞。② 物理方面，主要包括培養(yǎng)過程中影響濾膜堵塞速率的參數(shù)設(shè)置，如收獲液過濾速率 (單位膜面積單位時(shí)間內(nèi)收獲的液體量，L/(m2·h)) 及隔膜泵充氣和抽真空速率 (Pressure and exhaust，P/E flow，L/min)。Walther等[38]指出濾膜堵塞速率與收獲液過濾速率成二次函數(shù)關(guān)系，且推薦操作過程中保持收獲液過濾速率要小于2.5 L/(m2·h)。針對(duì)P/E flow對(duì)濾膜堵塞速率的影響，目前存在兩種主流說法。一方面認(rèn)為較高的P/E flow在抽真空階段會(huì)存在較強(qiáng)的液體反向沖刷作用，有利于沖刷掉黏附于濾膜表面的微粒物質(zhì)，避免柱子的堵塞[34,39]；一方面則指出較高的P/E flow對(duì)細(xì)胞存在較高的剪切力，而損傷的細(xì)胞會(huì)釋放更多引起濾膜堵塞的微粒，加速濾膜堵塞，縮短中空纖維柱在一輪實(shí)驗(yàn)中的使用壽命[38]。雙方觀點(diǎn)各有一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此增大 P/E flow對(duì)濾膜堵塞速度的影響尚未定論，仍需進(jìn)一步的研究來提供支持。

4.2.3 減緩或避免目的產(chǎn)物截留的措施

尋求減緩甚至避免產(chǎn)物截留的措施，進(jìn)而提高工藝的穩(wěn)健性并提高目的產(chǎn)物收率、降低生物藥物的生產(chǎn)成本一直是業(yè)界努力的目標(biāo)。

Mercille等[40]從減少堵塞濾膜微粒總含量出發(fā)，指出可以通過在SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)過程中，將培養(yǎng)基中加入DNase Ⅰ以降低濾膜堵塞速率。但作者并未進(jìn)一步考察DNase Ⅰ的加入對(duì)目的產(chǎn)物質(zhì)量的影響及對(duì)下游目的產(chǎn)物純化工藝的影響，此外，在培養(yǎng)體系中所引入生物試劑的殘留檢測(cè)也會(huì)是藥物質(zhì)量把關(guān)中不得不面對(duì)的新問題。Wang等[41]從中空纖維柱自身特性出發(fā)，以CHO細(xì)胞株展開實(shí)驗(yàn)，提出可以使用較大孔徑 (如5 μm) 的中空纖維柱以降低濾膜堵塞速率。但近年來將反應(yīng)器灌流培養(yǎng)與下游純化工藝相結(jié)合的連續(xù)操作正逐漸興起[42]，更推薦使用 0.20 μm孔徑的中空纖維柱，可以省去下游深層過濾操作，提高工作效率，節(jié)約生產(chǎn)成本。Kim 等[43]通過在收獲系統(tǒng)中引入一個(gè)單向閥和一個(gè)由控制器和計(jì)時(shí)器關(guān)聯(lián)開關(guān)的夾管閥，避免了蠕動(dòng)泵的使用，將重組人凝血因子Ⅷ收率成功提高 1.46倍，且較之常規(guī)收獲系統(tǒng)不影響CHO細(xì)胞生長(zhǎng)情況。該收獲系統(tǒng)搭建較為復(fù)雜，計(jì)時(shí)器控制夾管閥的開關(guān)要求較高的邏輯性，技術(shù)難度較大，尚未推廣使用。Kwon等[44]提出一種新型的微流體細(xì)胞截留裝置 (Microfluidic cell retention device)，該裝置宏觀結(jié)構(gòu)類似粒子加速器，利用慣性分離細(xì)胞與蛋白產(chǎn)物，獲得了高達(dá)99%的產(chǎn)物回收率，并且培養(yǎng)過程細(xì)胞活率維持較高。但作者采用CHO細(xì)胞株驗(yàn)證此截留裝置時(shí)所采用工作體積僅有350 mL，并且目的細(xì)胞密度僅控制在20×106cells/mL，該密度針對(duì)灌流發(fā)酵仍然處于偏低水平，因此該裝置是否易于放大及是否能支持更高密度發(fā)酵時(shí)細(xì)胞不流失，仍需進(jìn)一步考察。

5 總結(jié)與展望

基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝單位工作體積高產(chǎn)量、高質(zhì)量、低成本的顯著優(yōu)勢(shì)，近年來隨著生物藥物市場(chǎng)的逐步擴(kuò)大，工業(yè)界和學(xué)術(shù)界普遍關(guān)注灌流工藝的開發(fā)和優(yōu)化，F(xiàn)DA也極大地鼓勵(lì)生物藥物生產(chǎn)工藝由傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)轉(zhuǎn)型到灌流培養(yǎng)[12,45]。本文通過綜述近年來在灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)和優(yōu)化上取得的進(jìn)步和提出的策略，為懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)的開發(fā)提供了參考。

除上文討論的優(yōu)化關(guān)鍵點(diǎn)，灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)仍面臨其他挑戰(zhàn)：① 成熟的小體積模型(Scale-down model) 的開發(fā)。優(yōu)良的小體積模型的開發(fā)，可以在優(yōu)化工藝時(shí)降低生產(chǎn)成本，提高篩選效率?，F(xiàn)提出灌流培養(yǎng)的小體積模型有深孔板和搖管等，此類模型不能完全模擬實(shí)際生產(chǎn)過程中連續(xù)換液和連續(xù)收獲的操作，不能很好地反饋目的產(chǎn)物收獲時(shí)對(duì)中空纖維柱濾膜的堵塞作用，此類模型也沒有 pH和溶解氧 (Dissolved oxygen，DO) 的實(shí)時(shí)控制，并不能完全模擬灌流培養(yǎng)中細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝狀態(tài)，作用較局限。② 目的產(chǎn)物關(guān)鍵質(zhì)量屬性調(diào)控方法的開發(fā)。糖型和電荷等的變化均會(huì)影響蛋白類藥物的有效性及在體內(nèi)的免疫原性，尤其是在生物類似藥的研發(fā)和申報(bào)時(shí)，對(duì)質(zhì)量的調(diào)控顯得更為重要。然而目前關(guān)于調(diào)節(jié)產(chǎn)物質(zhì)量的文獻(xiàn)報(bào)道多是基于傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)工藝，針對(duì)培養(yǎng)模式和細(xì)胞代謝狀態(tài)有別的灌流培養(yǎng)工藝，開發(fā)出特有的更有效的調(diào)節(jié)質(zhì)量策略仍需投入時(shí)間和精力。③ “亞批次”收獲產(chǎn)物之間質(zhì)量一致性的保證。灌流培養(yǎng)工藝周期較長(zhǎng) (一般>30 d)，培養(yǎng)期間目的產(chǎn)物連續(xù)收獲。盡管認(rèn)為灌流培養(yǎng)細(xì)胞生活環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，但隨著細(xì)胞倍增次數(shù)的增高，細(xì)胞代謝狀態(tài)可能發(fā)生改變，進(jìn)而影響到目的產(chǎn)物質(zhì)量的一致性，而該問題是藥物臨床研究申請(qǐng)不得不面對(duì)的關(guān)鍵問題。因此，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)批次培養(yǎng)到連續(xù)灌流培養(yǎng)的完全轉(zhuǎn)型，仍有較長(zhǎng)的路要走。