果膠甲酯酶的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

王勝，孟昆，羅會(huì)穎，姚斌，涂濤

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081

果膠物質(zhì)存在于相鄰細(xì)胞壁的胞間層中，起著將細(xì)胞粘在一起的作用，是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。柑橘、檸檬、柚子等果皮中約含30%果膠，是果膠的最豐富來源。按果膠的組成可分為同質(zhì)多糖和雜多糖兩種類型：同質(zhì)多糖果膠包括 D-半乳聚糖、L-阿拉伯聚糖和D-半乳糖醛酸聚糖等；雜多糖果膠最常見，是由半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖以不同比例組成，通常稱為果膠酸。果膠具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包含“平滑區(qū)域”和“毛狀區(qū)域”兩部分。平滑區(qū)域主要由α-1,4糖苷鍵連接的D-聚半乳糖醛酸殘基組成，其可在O6原子發(fā)生甲基化和在O2或O3原子發(fā)生乙?；揎?，而毛狀區(qū)域的特征在于含有 1,2-α-L-鼠李糖-1,4-α-D-半乳糖醛酸二聚體的形式延伸，其中富含 L-阿拉伯糖和 D-半乳糖的側(cè)鏈可被鼠李糖殘基取代[1-2]。由于果膠的復(fù)雜性，需要一系列果膠酶協(xié)同降解，包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、果膠乙酰酯酶等[3]。

果膠甲酯酶 (Pectin methylesterase，PME；EC 3.1.1.11) 能夠水解甲酯基，釋放甲醇從而降低果膠的甲酯化程度。PME在多種生物體中被發(fā)現(xiàn)，在高等植物中，大多數(shù)PME都存在于不同組織器官，如根、莖、葉、果實(shí)等，其對(duì)細(xì)胞壁組成和降解、細(xì)胞游離、花粉發(fā)育、種子萌發(fā)、根尖延伸、種子開裂、果實(shí)軟化、抗病等方面具有重要作用[4-7]，并且通常在一個(gè)物種中同時(shí)存在幾種不同類型的 PME。這些內(nèi)源性的酶通常具有組織特異性，并且有助于植物發(fā)育和果實(shí)成熟期間細(xì)胞壁的變化；在微生物中，PME主要存在于真菌 (如曲霉菌)、細(xì)菌 (如歐文氏菌)。其次，某些植食性昆蟲體內(nèi)也相繼發(fā)現(xiàn)了PME的存在[4,8-10]。

PME是一種重要的果膠酶。目前在食品加工、茶飲料、造紙等生產(chǎn)工藝中已廣泛應(yīng)用PME來改善產(chǎn)品品質(zhì)，如PME與多聚半乳糖醛酸酶一起使得果汁澄清的效果顯著增強(qiáng)[11]。并且PME是許多植物病原體侵染植物的關(guān)鍵酶，對(duì)PME的研究也可以促進(jìn)其對(duì)植物病原體侵染植物組織機(jī)理的理解，已成為植物學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)新的熱點(diǎn)。但因?yàn)榉€(wěn)定性差、酶活低等特性，極大地限制了PME的廣泛使用，所以對(duì)PME的功能改造也逐漸提上日程。而結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究是蛋白質(zhì)功能定向改造強(qiáng)有力的支撐，通過對(duì)PME結(jié)構(gòu)的研究來揭示酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系成為目前研究的重點(diǎn)。本文在已報(bào)道PME的晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對(duì)PME在結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究進(jìn)行綜述。

1 果膠甲酯酶的總體結(jié)構(gòu)

PME屬于碳水化合物酯酶第8家族[12](Family 8 carbohydrate esterase，CE8s；http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY)。目前，已有40種不同的CE8s被表征為PME蛋白，其從果膠內(nèi)的甲酯化半乳糖醛酸中去除甲酯基，這也是細(xì)胞壁更新、果實(shí)成熟和致病等過程中的重要生物學(xué)事件[13]。

2000年 Jenkins等[14]報(bào)道了歐文氏菌來源的PME (PemA；PDB ID：2NTB) 晶體結(jié)構(gòu)，這也是PME的第一個(gè)結(jié)構(gòu)。隨著對(duì)PME結(jié)構(gòu)的深入研究，至今已經(jīng)得到了7個(gè)不同來源的PME的晶體結(jié)構(gòu)(表1)。針對(duì)這7個(gè)不同來源的PME我們進(jìn)行了多序列比對(duì)分析 (圖1)，盡管這7種不同來源PME氨基酸序列相似性較低 (21%–62%)，但它們?nèi)S結(jié)構(gòu)相似，下面將進(jìn)行具體介紹。

表1 已報(bào)道晶體結(jié)構(gòu)的果膠甲酯酶Table 1 The pectin methylesterases with known crystal structure

圖1 已報(bào)道結(jié)構(gòu)的果膠甲酯酶多序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Multiple sequence alignment results of PME with known crystal structure. The sequences used in the multiple sequence alignment analysis are download from crystal structures of the PDB database.

目前已報(bào)道的大多數(shù)酯酶采用 α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)并含有催化三聯(lián)體Ser-His-Asp。但PME既沒有共同的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)，也沒有常見的催化三聯(lián)體[14]。PME屬于右手平行 β-螺旋結(jié)構(gòu)[19](圖2A)，對(duì)應(yīng)每圈的β-折疊片分別定義為PB1、PB2和 PB3。連接這3個(gè) β-折疊片的轉(zhuǎn)角分別稱為T1(PB1-PB2)、T2 (PB2-PB3) 和 T3(PB3-PB1)[14,18](圖2B)。不同來源的PME其完整的β-螺旋圈數(shù)也不相同，其中番茄來源的PME (PDB ID：1XG2) 只有7個(gè)完整的β-螺旋圈[17]。

圖2 胡蘿卜PME的結(jié)構(gòu) (PDB ID：1GQ8)Fig. 2 The crystal structure of PME from carrot (PDB ID:1GQ8). (A) Front view. (B) Side view from N-terminal.

以胡蘿卜PME (PDB ID：1GQ8) 為例，在整個(gè)結(jié)構(gòu)中，PB1是最長(zhǎng)的折疊片結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中存在11股平行的PB1折疊片，其中第一條與最后一條大致垂直。第一個(gè)β折疊片之前的N末端存在7個(gè)游離的氨基酸殘基，C末端也存在一段短的無序結(jié)構(gòu)。但也有特殊情況存在，如水稻象鼻蟲來源的PME (PDB ID：4PMH) 的結(jié)構(gòu)在整體的空間構(gòu)象上與其他PME的結(jié)構(gòu)保持一致，但是將其與其他來源的PME結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)水稻象鼻蟲來源的PME的C末端結(jié)構(gòu)與其他來源PME的N末端結(jié)構(gòu)能很好地?cái)M合 (圖3)。像這種蛋白質(zhì)序列的循環(huán)排列是非常罕見的，但確實(shí)是自然發(fā)生的[20]。這種結(jié)構(gòu)上的循環(huán)排列可能源于自然遺傳或翻譯后修飾導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)重排。從所有水稻象鼻蟲 PME蛋白的編碼RNA序列來看，這種循環(huán)置換排列是起源于遺傳的。研究人員又將其他來源的象鼻蟲PME序列與水稻象鼻蟲PME序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)都具有延伸的N-末端區(qū)域和縮短的C-末端區(qū)域，表明該結(jié)構(gòu)的循環(huán)置換屬于昆蟲家族特有的結(jié)構(gòu)特征，因此也證明了蛋白質(zhì)中存在結(jié)構(gòu)循環(huán)排列現(xiàn)象[8]。

圖3 歐文氏菌PME (PDB ID：2NTB) (A) 和水稻象鼻蟲PME (PDB ID：4PMH) (B) 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Fig. 3 The structural features of Erwinia PME (PDB ID:2NTB) (A) and rice weevil PME (PDB ID: 4PMH) (B).

T1轉(zhuǎn)角區(qū)較短，其中胡蘿卜來源的PME通常沒有殘基或只有1個(gè)殘基連接PB1和PB2[18]，而水稻象鼻蟲來源的PME比其他來源的PME T1轉(zhuǎn)角區(qū)較長(zhǎng)。T2和T3轉(zhuǎn)角區(qū)域通常包含較長(zhǎng)的loop區(qū)，且蛋白分子表面的裂縫都由T2和T3區(qū)域這些較長(zhǎng)的loop區(qū)組成。根據(jù)前面所述序列比對(duì)結(jié)果可知，來源于同一界的PME其序列一致性比較高，其在結(jié)構(gòu)上的差異越小；來源于不同界的PME雖然在整體結(jié)構(gòu)上都為右手平行 β-螺旋結(jié)構(gòu)且催化核心部分結(jié)構(gòu)也較為保守，但是不同來源的PME在其結(jié)構(gòu)上也存在很大差異，例如，β折疊片以及轉(zhuǎn)角長(zhǎng)度等，其中差異最大處在于連接 β折疊片的轉(zhuǎn)角區(qū)，由于其向外延伸長(zhǎng)度各不相同，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)角處所形成的 loop區(qū)的大小以及結(jié)構(gòu)各異。例如將歐文氏菌來源的PME (PDB ID：2NTB)與胡蘿卜來源的PME (PDB ID：1GQ8) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì) (RMSD值為1.80 ?) 發(fā)現(xiàn)，其最大的不同之處在于T2和T3 loop區(qū)鏈長(zhǎng)度的不同，歐文氏菌來源的PME其T2與T3 loop區(qū)較長(zhǎng)且結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜 (圖 4)。

2 果膠甲酯酶的催化域

PME結(jié)構(gòu)表面由較長(zhǎng)的T2 loop區(qū)和T3 loop區(qū)形成裂縫，該裂縫的中心部分由幾個(gè)芳香族氨基酸組成，這符合碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)的特征[18]。Fries等[16]對(duì)歐文氏菌來源的PME (PDB ID：2NTB)與其底物共晶體的結(jié)構(gòu)研究也進(jìn)一步證實(shí)，六糖底物結(jié)合在酶表面的裂縫中。Teller等[8]分析了CE8s家族的 PME的結(jié)構(gòu)以及序列，總結(jié)了部分 PME中的活性位點(diǎn)殘基 (表2)。以歐文氏菌來源的PME為例，酶與底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明以下殘基參與催化反應(yīng)：Asp199、Asp178和Gln177 (圖5)。

圖4 歐文氏菌 (2NTB) 和胡蘿卜 (1GQ8) 來源的PME基于序列以及結(jié)構(gòu)對(duì)比分析結(jié)果 (A：歐文氏菌(2NTB：橘色) 和胡蘿卜 (1GQ8：淺藍(lán)色) 來源的PME序列比對(duì)結(jié)果，其中|為結(jié)構(gòu)上相對(duì)應(yīng)且殘基一致，:為結(jié)構(gòu)上相對(duì)應(yīng)且殘基相似，.為結(jié)構(gòu)上相對(duì)應(yīng)但二者殘基不同. B：歐文氏菌 (2NTB：橘色) 和胡蘿卜 (1GQ8：淺藍(lán)色) 來源PME結(jié)構(gòu)比對(duì)，其中灰色表示差異較大部分)Fig. 4 Results of sequence and structural comparison analysis of PME derived from Erwinia (2NTB) and carrot(1GQ8). (A) The sequence alignment of PME from Erwinia chrysanthemi (2NTB, up) and Daucus carota(1GQ, down), where | means structurally equivalent and identical residues, : means structurally equivalent and similar residues, . means structurally equivalent, but different residues. (B) The structure alignment of PME from bacteria (2NTB, orange) and plants (1GQ8, light blue), the gray color indicating the significance difference.

表2 CE8s蛋白中的活性位點(diǎn)殘基Table 2 Active site residues in CE8s protein

圖5 歐文氏菌PME (2NTB) 活性位點(diǎn)相關(guān)殘基Fig. 5 The active sites of Erwinia PME (2NTB).

在之前的研究中，Markus等[15]對(duì)歐文氏菌來源的PME (PDB ID：2NTB) 晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究時(shí)首先提出催化位點(diǎn)為保守的天冬氨酸 (Asp178和Asp199) 和精氨酸 (Arg267)。但是經(jīng)過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)第 267位的精氨酸并不直接參與酶的催化[14]。后續(xù)研究提出了以下催化機(jī)制：殘基Asp178通過與糖側(cè)鏈上甲酯羰基的氧原子結(jié)合形成氫鍵，殘基Asp199側(cè)鏈上的羧基攻擊糖側(cè)鏈上的羰基碳原子形成四面體中間體，此時(shí)羰基氧原子上帶有一個(gè)負(fù)電荷。該氧原子通過與 Gln177和 Asp178殘基之間的相互作用來穩(wěn)定自身的負(fù)電荷。由Asp178殘基側(cè)鏈上的羧基氫原子使離去基團(tuán)質(zhì)子化，形成酸酐中間體同時(shí)釋放甲醇。隨后由Asp178側(cè)鏈去質(zhì)子化后的羧基催化水分子水解酸酐中間體，并形成最終產(chǎn)物 (圖 6)。在該催化過程中，Asp199是直接攻擊甲酯羰基碳的親核試劑，Asp178是反應(yīng)中的一般酸堿，而Gln177則通過形成氧陰離子孔來穩(wěn)定過渡態(tài)，相鄰的Gln153殘基主要有助于底物結(jié)合，但是也有部分研究人員認(rèn)為是由兩個(gè)相鄰的谷氨酰胺側(cè)鏈形成的陰離子孔穩(wěn)定帶負(fù)電的四面體中間體[18]。與歐文氏菌來源的PME催化機(jī)理類似，植物來源的PME具有相同的催化機(jī)理。以胡蘿卜來源的PME (PDB ID：1GQ8)為例，胡蘿卜PME中Asp157、Asp136和Gln135分別起到親核試劑、一般酸堿和穩(wěn)定四面體中間體的作用。

人們對(duì)多糖的酶促轉(zhuǎn)化提出了3種作用模式：(1) 單鏈機(jī)制，酶與底物結(jié)合后，其鏈上所有連續(xù)的底物位點(diǎn)都被轉(zhuǎn)化；(2) 多鏈機(jī)制，每次反應(yīng)完成后，酶-底物復(fù)合物解離，即每次反應(yīng)僅轉(zhuǎn)化單個(gè)底物殘基；(3) 多重攻擊機(jī)制，對(duì)于每次形成的酶-底物復(fù)合物，酶催化平均數(shù)量有限的糖殘基的轉(zhuǎn)化[15]。針對(duì)這幾種作用模式，部分研究中認(rèn)為：植物和細(xì)菌來源的PME催化甲酯果膠產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸鏈，對(duì)應(yīng)提出單鏈和多鏈催化機(jī)制[21-23]。相反，真菌PME更加隨機(jī)地行使催化活性，對(duì)應(yīng)提出多重攻擊機(jī)制[24-26]。但是在另一部分研究中提出了不同的見解：酸性微生物PME (日本曲霉、黑曲霉、油曲霉) 催化甲酯基的隨機(jī)裂解，屬于多鏈催化機(jī)制。高等植物 (番茄、橘子、苜蓿) 和真菌(里氏木霉) 來源的堿性PME水解產(chǎn)生游離羧基的嵌段，它們沿糖鏈線性催化果膠脫甲酯基，屬于單鏈催化機(jī)制[27]。

在目前所有表征的結(jié)果中，PME持續(xù)催化的方向是從多聚半乳糖醛酸 (High polygalacturonic acid，HG) 鏈的非還原端朝向還原端。PME持續(xù)催化的能力很大程度上依賴于溶劑中的離子強(qiáng)度和pH等因素[16]，由于不同來源PME其等電點(diǎn)不同，導(dǎo)致不同pH值緩沖溶液中PME的整體帶電性質(zhì)的不同，從而影響底物分子與酶活性口袋的結(jié)合。例如在 Jean-Marc等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，蘋果PME在不同的 pH條件下由于酶與底物的作用方式的變化直接影響了其催化效果，在pH 7.0時(shí)具有典型的單鏈機(jī)理，但在pH 4.5時(shí)與單鏈和多鏈機(jī)理不同其屬于多重攻擊機(jī)制。同時(shí)Kent等[16]對(duì)黑曲霉來源的PME催化的持續(xù)性 (Processive) 特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明酶和底物的高度帶電性也會(huì)對(duì)酶與底物的結(jié)合產(chǎn)生影響。細(xì)菌和植物來源的PME通過靜電吸引力使得帶負(fù)電荷的底物持續(xù)保留在結(jié)合位點(diǎn)，從而有利于酶的持續(xù)性催化反應(yīng)。相反，黑曲霉來源的PME對(duì)底物產(chǎn)生靜電排斥作用，從而促進(jìn)底物的解離和隨機(jī)的非持續(xù)性酶促作用[16]。

圖6 基于定向突變體的晶體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)分析提出的PME的催化機(jī)制[15]Fig. 6 The catalytic mechanism of PME based on crystal structure and kinetic analysis of directed mutants[15].

3 碳水化合物結(jié)合方式以及底物特異性

Fries等[15]對(duì)歐文氏菌來源的PME進(jìn)行研究過程中，使用失活突變體D178A獲得了PME與特異性甲基化的六聚半乳糖醛酸鹽的晶體復(fù)合物。并使用了以下 4種底物：底物Ⅰ-MMCCCM；底物Ⅱ-CCMMMC；底物Ⅲ-MCCCCM；底物Ⅳ-CMMMMC(寡糖序列以從非還原端到還原端的方式給出，其中 M 和 C分別表示甲基化的聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic acid，Gal A) 和未甲基化的Gal A)對(duì)PME的底物特異性進(jìn)行了研究。通過對(duì)這4種底物與酶結(jié)合方式的研究表征了酶的結(jié)合位點(diǎn)以及酶對(duì)不同甲基化底物的偏好性。底物Ⅰ和Ⅲ各自以相同的方式與 PME結(jié)合，非還原末端位于亞位點(diǎn)-5位置，還原末端位于亞位點(diǎn)+1 (活性位點(diǎn)指定為亞位點(diǎn)+1)位置。底物Ⅱ和Ⅳ的結(jié)合模式不同于底物Ⅰ和Ⅲ的結(jié)合模式，底物Ⅱ與亞位點(diǎn)-2至+4位置結(jié)合，而底物Ⅳ占據(jù)亞位點(diǎn)-1至+5位置 (表3)。

對(duì)晶體中底物-酶相互作用的分析表明，底物結(jié)合涉及的亞位點(diǎn)為-2、-1、+1、+2和+3，其中最重要的是亞位點(diǎn)-1和+1[15]。亞位點(diǎn)-1和-2總是被非甲基化的Gal A占據(jù)，這意味著該位點(diǎn)對(duì)糖鏈上羧基的強(qiáng)烈偏好。相反，在所有的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)催化位點(diǎn)結(jié)合的是甲基化的Gal A，表明催化位點(diǎn)對(duì)糖側(cè)鏈上的甲酯基具有較強(qiáng)的偏好。在亞位點(diǎn)+2位置處，C6取代基面向溶劑，解除了酶對(duì)底物側(cè)鏈的空間位阻；因此，甲基化或未甲基化的Gal A都可以結(jié)合在亞位點(diǎn)+2處。在亞位點(diǎn)+3位置含有疏水口袋，所以該亞位點(diǎn)更青睞于側(cè)鏈含甲酯基的底物。雖然在亞位點(diǎn)+4、+5、-4和-5位置也分別結(jié)合著不同甲酯化的底物，但是這些位置氫鍵較少與底物的相互作用少，所以最佳的結(jié)合位點(diǎn)為亞位點(diǎn)-2至+3且其最佳底物為CCMXM (X表示甲基化或非甲基化底物皆可)。

對(duì)PME同系物中底物結(jié)合涉及到的氨基酸保守程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要包括Thr109、Gln153、Gln177、Val198、Asp199、Phe202、Lys223、Val227、Ser228、Gly229、Arg267和 Trp269。其中部分非保守性氨基酸也有助于底物的結(jié)合，如 Ala110、Arg219、Asn226、Tyr230、Thr272、Arg279和 Met306(圖 7)。其中與果膠分子中甲酯基和羧基結(jié)合的殘基可能有助于穩(wěn)定底物的構(gòu)象。在亞位點(diǎn)-4和-5位置處沒有氨基酸與果膠分子接觸表明亞位點(diǎn)–3位置非還原端一側(cè)底物側(cè)鏈無論是甲酯基還是羧基都可以；另一方面，亞位點(diǎn)-3位置處的Arg279與底物的羧基結(jié)合，該帶正電荷的殘基與羧基的接觸表明該位點(diǎn)優(yōu)選側(cè)鏈帶羧基而不是甲酯基的底物。在亞位點(diǎn)-2位置處，Ala110的主鏈酰胺和另一些晶體復(fù)合物中的 Thr109與底物羧基的兩個(gè)氧形成氫鍵，與該位點(diǎn)對(duì)底物側(cè)鏈為羧基的偏好性相關(guān)。同樣，在亞位點(diǎn)-1處涉及的Trp269和 Thr272 (主鏈酰胺和側(cè)鏈羥基) 與底物側(cè)鏈羧基形成的氫鍵也揭示了此位點(diǎn)對(duì)羧基的偏好性。其次，甲酯基在活性位點(diǎn)的特異性結(jié)合可歸因于由殘基Phe202、Trp269和Met306產(chǎn)生的疏水環(huán)境。在亞位點(diǎn)+2處，底物側(cè)鏈面向溶劑，因此亞位點(diǎn)+2不涉及底物特異性。Val198、Val227和Tyr230形成的疏水口袋，用于在亞點(diǎn)+3位置處結(jié)合酯的甲基官能團(tuán)。亞點(diǎn)+4和+5處的Gal A的C6取代基不與蛋白質(zhì)相互作用，因此預(yù)測(cè)亞基+4和+5不會(huì)對(duì)果膠底物的特定甲基化模式產(chǎn)生特異性。

表3 各種不同甲酯化底物在底物結(jié)合口袋的結(jié)合方式Table 3 The binding pocket with various methyl esterification substrates

圖7 PME活性口袋中涉及的與底物結(jié)合相關(guān)氨基酸殘基分布以及與底物相互作用示意圖 (A：與各種底物結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基分布情況；B：涉及的相互作用示意圖)[15]Fig. 7 Schematic representation of the distribution of amino acid residues associated with substrate binding involved in the PME active pocket and the interaction of the enzyme with the substrate. (A) Distribution of amino acid residues associated with various substrate bindings. (B)Schematic diagram of interactions involved[15].

4 總結(jié)與展望

隨著近幾十年來對(duì) PME的不斷深入研究，PME的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理也逐漸被認(rèn)識(shí)，但是目前僅僅對(duì)一種來源的PME與其底物復(fù)合物進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)的表征，雖然其他科研人員也對(duì)PME與其底物的結(jié)合方式進(jìn)行了一定的研究，但都是在此基礎(chǔ)上對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)或者是利用分子對(duì)接技術(shù)等間接方法對(duì)酶的催化機(jī)制展開研究，具有一定的局限性。此外，目前已報(bào)道的PME晶體結(jié)構(gòu)較少，對(duì)我們進(jìn)一步了解PME催化機(jī)理以及底物特異性等方面也有一定的局限性。

其次，針對(duì)酶性能改造的蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)于酶的商業(yè)化非常重要。候選酶的工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)瓶頸是低催化效率[28]。近幾十年來研究人員已經(jīng)開發(fā)了譬如從頭設(shè)計(jì)、基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)等多種方法來改善酶催化性能[29-31]。對(duì)酶的功能設(shè)計(jì)是基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)層面深入認(rèn)知后展開的，并且理性設(shè)計(jì)也可以用于確定與酶催化相關(guān)的重要氨基酸殘基等相關(guān)因素[32]。顯然，針對(duì)這些基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)展開的研究工作，目前僅有的幾個(gè) PME晶體結(jié)構(gòu)不具廣泛的代表性。

此外，除了對(duì)PME的催化性能進(jìn)行理性設(shè)計(jì)以滿足工業(yè)生產(chǎn)需求外，PME也是許多植物病原菌侵染植物的關(guān)鍵酶。通過對(duì)不同植物病原菌所產(chǎn)PME的催化機(jī)制研究，我們可以有效地針對(duì)其催化性質(zhì)設(shè)計(jì)抑制劑，以減輕其對(duì)植物造成的危害；并且在現(xiàn)階段的研究工作中，也已經(jīng)有部分研究人員發(fā)現(xiàn)了 PME的抑制蛋白[17]，通過同時(shí)對(duì) PME以及其抑制蛋白作用方式的研究，進(jìn)一步了解其催化特性以及起到抑制作用的關(guān)鍵因素，為理性設(shè)計(jì)抑制劑提供理論支持。

由此可見，繼續(xù)推進(jìn)對(duì)不同來源的PME結(jié)構(gòu)研究，進(jìn)一步揭示PME的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及催化機(jī)理與催化方式是十分重要的。目前報(bào)道的7種PME結(jié)構(gòu)各不相同，并且已經(jīng)報(bào)道不同來源的PME其催化方式也略有差異，這就更加要求我們加快研究的步伐。