輔助性T淋巴細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在Graves病合并甲狀腺過氧化物酶抗體陽性患者中的機(jī)制研究

尚恒 馬金剛 魏紅麗 楊華 范斌 路林峰

甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)屬于破壞性抗體，其滴度水平反映了甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤及甲狀腺自身免疫損傷的程度，是橋本甲狀腺炎(HT)的標(biāo)志性抗體[1]。促甲狀腺素受體抗體(TRAb)是Graves病(GD)的致病性抗體，但GD患者中TPOAb的陽性率高達(dá)80%左右[2]。且伴有高水平TPOAb的GD患者給予抗甲狀腺藥物治療后易出現(xiàn)早發(fā)甲狀腺功能減退(簡稱甲減)[3]，輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)17、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)參與了甲狀腺組織自身免疫損傷，Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡在HT的發(fā)生發(fā)展及TPOAb等甲狀腺自身抗體的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[4]。我們通過分析TPOAb陽性的GD患者Th17、Treg水平及兩者比值的變化，探討Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡在GD患者TPOAb產(chǎn)生中的作用。

對象與方法

1.對象：選取2017年12月～2018年6月就診于我院的GD患者160例，均為初發(fā)GD且未經(jīng)治療。GD診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)高代謝的癥狀和體征；(2)觸診及超聲檢查結(jié)果顯示甲狀腺彌漫性腫大；(3)血清總甲狀腺素(TT4)、游離甲狀腺素(FT4)水平增高，促甲狀腺激素(TSH)水平降低；(4)眼球突出和其他浸潤性眼征；(5)脛前黏液性水腫；(6)TRAb、甲狀腺刺激性抗體(TSAb)、TPOAb陽性；以上(1)～(3)項(xiàng)為診斷必備條件，(4)～(6)項(xiàng)為診斷輔助條件。排除其他自身免疫性疾病及合并腫瘤、妊娠的患者。其中男36例，女124例，年齡15～79歲，平均年齡(32.38±6.36歲)歲。根據(jù)TPOAb水平將納入患者分為4組：TPOAb陰性組(TPOAb≤35 IU/ml)32例、TPOAb輕度升高組(35 IU/ml500 IU/ml)20例。另選取同期我院健康體檢者20例作為對照組，其中男5例，女15例，年齡20～47歲，平均年齡(32.51±6.27)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過。

2.方法

(1)標(biāo)本采集及相關(guān)指標(biāo)檢測：抽取受試者空腹外周靜脈血5 ml，檢測其甲狀腺功能、甲狀腺自身抗體及細(xì)胞因子水平。采用化學(xué)發(fā)光法檢測FT3、FT4、TSH水平，檢測設(shè)備為羅氏Cobas e601型電化學(xué)發(fā)光分析儀。采用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測TRAb、TPOAb水平，檢測設(shè)備為美國Beckman coulter分析儀。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、白細(xì)胞介素(IL)-17水平，試劑盒購自美國R&D公司，按照試劑盒操作說明進(jìn)行檢測。

(2)Treg和Th17檢測：抽取所受試者的空腹外周血5 ml，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行Treg和Th17的檢測。①Treg檢測：收集PBMC，加入藻紅蛋白(PE)-抗人CD4單克隆抗體、PE-抗人CD25-藻藍(lán)蛋白(APC)進(jìn)行細(xì)胞表面染色、PE-抗人Foxp3單克隆抗體(均購自美國eBioscience公司)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色，采用流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)進(jìn)行檢測分析。②Th17檢測：將PBMC懸液置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入25 ng/ml佛波酯(美國Alexis公司)200 μl和1 μg/ml伊諾霉素(美國Alexis公司)200 μl后，在37 ℃孵育箱中培養(yǎng)4小時(shí)，收集細(xì)胞，加入PE-抗人CD4單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色、PE-抗人IL-17A單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)因子染色，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。應(yīng)用CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞表示Treg比例，CD4+IL-17A+T淋巴細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞表示Th17比例。

結(jié) 果

1.5組受試者一般資料、甲狀腺功能及TRAb水平比較：5組受試者的年齡和性別構(gòu)成兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組GD患者的FT3、FT4和TRAb水平均明顯高于對照組，TSH水平明顯低于對照組(P<0.05)。其中TPOAb重度升高組的FT4和TRAb水平明顯高于其余3組GD患者(P<0.05)，且這3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組GD患者的FT3和TSH水平兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組受試者一般資料、甲狀腺功能及TRAb水平比較

2.5組受試者Th17和Treg表達(dá)及Th17/Treg比值比較：4組GD患者的Th17表達(dá)及和Th17/Treg比值均明顯高于對照組，且TPOAb重度升高組明顯高于其余3組GD患者，TPOAb中度升高組明顯高于TPOAb陰性組和TPOAb輕度升高組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TPOAb陰性組與TPOAb輕度升高組的Th17表達(dá)和Th17/Treg比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組GD患者的Treg表達(dá)均低于對照組(P<0.05)，但各GD組患者兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組受試者Th17和Treg表達(dá)及Th17/Treg比值比較

3.5組受試者IL-17和TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較：4組GD患者的IL-17水平和IL-17/TGF-β比值均明顯高于對照組，且TPOAb重度升高組明顯高于其余3組GD患者，TPOAb中度升高組明顯高于TPOAb-陰性組和TPOAb輕度升高組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TPOAb陰性組與TPOAb輕度升高組IL-17水平和IL-17/TGF-β比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組GD患者TGF-β水平均明顯高于對照組(P<0.05)，但各GD組患者兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組受試者IL-17和TGF-β水平及IL-17/TGF-β比值比較

討 論

TPOAb是一種免疫球蛋白G，可與甲狀腺素合成過程中的關(guān)鍵酶甲狀腺過氧化物酶發(fā)揮協(xié)同作用，從而抑制甲狀腺激素的合成，導(dǎo)致甲減。TPOAb可反映甲狀腺濾泡細(xì)胞破壞的程度和自身免疫狀態(tài)，是HT的標(biāo)志性抗體[5]。GD為一種器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞免疫及體液免疫異常關(guān)系密切，TRAb是其致病性抗體，而GD伴TPOAb水平升高可能與甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)-Ⅱ類抗原表達(dá)增加，甲狀腺過氧化物酶釋放入血產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)有關(guān)[6]。

本研究根據(jù)TPOAb水平升高程度對GD患者進(jìn)行分組研究發(fā)現(xiàn)，TPOAb重度升高GD患者的FT4和TRAb水平均明顯高于TPOAb陰性及輕、中度升高TPOAb患者。任麗萍等[7]通過病理研究證實(shí)，甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤程度與血清TPOAb滴度存在明顯相關(guān)性，表明TPOAb滴度重度升高患者的甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤程度較嚴(yán)重，細(xì)胞免疫及體液免疫炎性反應(yīng)劇烈。而FT4、TRAb水平可以直接反映甲狀腺細(xì)胞功能亢進(jìn)程度及疾病活動(dòng)度，因此TPOAb重度升高GD患者FT4、TRAb水平明顯升高。但需要警惕該組患者存在GD合并HT的可能性，其甲狀腺功能可能在甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱甲亢)和甲減之間頻繁波動(dòng)[8]。

Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡在自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Th17的浸潤程度與GD嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。本研究對各組GD患者外周血Th17、Treg及其分泌的細(xì)胞因子IL-17、TGF-β分析發(fā)現(xiàn)，TPOAb重度升高組GD患者Th17比例、Th17/Treg比值及IL-17水平均明顯高于其余各組，且該組患者的FT4、TRAb水平明顯升高，與上述研究結(jié)論一致，表明TPOAb重度升高的GD患者甲狀腺存在嚴(yán)重的自身免疫紊亂。同時(shí)，IL-17作為重要的促炎因子，一方面可誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，引起炎性細(xì)胞浸潤和甲狀腺組織損傷，另一方面IL-17還可以協(xié)同干擾素γ增強(qiáng)甲狀腺自身抗原的表達(dá)，激活Th細(xì)胞，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生甲狀腺自身抗體，這些抗體可通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)進(jìn)一步攻擊破壞甲狀腺組織細(xì)胞[10]。而TPOAb中度升高組GD患者的Th17比例、Th17/Treg比值及IL-17水平均明顯高于TPOAb陰性組和TPOAb輕度升高組，但其FT4水平明顯低于TPOAb重度升高組。這似乎與上述結(jié)論相矛盾，苑姍姍等[11]研究認(rèn)為，TPOAb在單純GD、GD合并HT及HT這3種甲狀腺自身免疫疾病中所發(fā)揮的作用不同，可能與TPOAb亞型的分布及含量差異有關(guān)。Khan等[1]認(rèn)為，GD患者血清中高滴度的TPOAb提示可能存在GD合并HT。綜合上述研究的結(jié)論推測，TPOAb中度升高組GD患者甲狀腺病理組織學(xué)改變與TPOAb重度升高組有差異，且兩組間TPOAb亞型及Th17細(xì)胞所發(fā)揮的作用存在差異，其機(jī)制有待進(jìn)一步病理學(xué)及免疫學(xué)研究探討。

綜上，TPOAb中重度升高GD患者的Th17比例及IL-17水平明顯升高，且Th17/Treg免疫失衡較為嚴(yán)重。臨床上對于合并高水平TPOAb的GD患者，應(yīng)警惕GD合并HT的可能性，TPOAb可作為重要免疫損傷監(jiān)測指標(biāo)幫助臨床醫(yī)生更好地評估GD的治療及預(yù)后。