ALG3作為潛在生物標(biāo)志物在膀胱癌組織中的表達及其臨床意義

李伯全 康勝虎 王蕊

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院泌尿外科，天津300142

0 引 言

膀胱癌發(fā)病率高，是世界上最常見的癌癥之一[1]。世界上，每年有將近43萬人被診斷為膀胱癌[2]。通常，膀胱癌可分為肌肉浸潤性膀胱癌（muscleinvasive bladder cancer，MIBC）和非肌肉浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）。據(jù)統(tǒng)計，NMIBC占膀胱癌的70%，而MIBC僅占膀胱癌的30%，但80%的NMIBC在后期會發(fā)展為MIBC[3]。2012年，美國的一項全國性統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果顯示，每10萬美國人中就有近7人患有膀胱癌，這一發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第9位[4]。膀胱癌的發(fā)生沒有年齡限制，任何年齡階段的人群都有可能會患此病，但其發(fā)病率隨年齡增長而增加，其最高發(fā)年齡段為50～70歲，且膀胱癌也呈現(xiàn)出明顯的性別特征，男性的發(fā)病率是女性的3～4倍[5]。盡管近年來針對膀胱癌的治療已取得了很大的發(fā)展和進步[4]，但目前膀胱鏡檢查和尿細胞學(xué)檢查仍是膀胱癌的主要診斷和監(jiān)測手段[6]。但是，這些技術(shù)存在很大的局限性，在很多時候不能提供令人滿意的結(jié)果[7]。因此，開發(fā)與膀胱癌發(fā)生過程中基因變化相關(guān)的新型標(biāo)記物[8]，有助于更好地認(rèn)識、監(jiān)測及治療膀胱癌，并改善膀胱癌患者的臨床預(yù)后。

天冬酰胺連接糖基化 3（asparagine-linked glycosylation 3，ALG3），即 α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，是ALG家族成員，位于染色體3q27.1區(qū)[9]。ALG3的上調(diào)可能影響食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，上調(diào)的ALG3可刺激宮頸癌細胞的增殖[10]。多項研究結(jié)果表明，ALG3在各種癌癥中都有顯著表達，且提示不良預(yù)后。其中，ALG3在頭頸部鱗狀細胞癌中表達顯著。有研究者對ALG3在乳腺癌中的表達特征進行了研究，證明ALG3在癌癥中的高表達特征，并提示不良預(yù)后[11-12]。大量的研究結(jié)果表明，ALG3有望作為許多癌癥的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點。但是，關(guān)于ALG3在膀胱癌中的臨床病理意義和功能作用的研究較少，有待進一步探討。

本研究中，旨在探討ALG3在膀胱癌組織及相應(yīng)正常組織中的相對表達及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，有助于更好地認(rèn)識ALG3在膀胱癌發(fā)展中的作用機制，從而對研究監(jiān)測及治療膀胱癌的新方法有十分重要的意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2010年1月至2018年12月，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院泌尿外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的膀胱癌患者87例。其中，男性59例，女性28例，年齡58.3歲±65.9歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實，并具有完整的病例資料。收集患者的腫瘤組織樣本和相應(yīng)的癌旁正常組織樣本。根據(jù)AJCC-TNM-2010分類系統(tǒng)和WHO/ISUP-2016系統(tǒng)分別評估腫瘤分期和分級[13-14]。本研究以1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

山羊血清封閉液、免疫組化二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

RM2235型石蠟切片機、光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測方法

將病理組織石蠟包埋并切片，此后放入58℃的烘箱中45 min；然后將切片先后放進2個二甲苯罐中各處理10 min，梯度乙醇溶液處理（100%、90%、75%，各5 min）；將處理過的切片用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 5 min，重復(fù) 3 次；將切片浸泡在體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液中處理10 min，避免非特異性染色；PBS洗滌3次；將切片放在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的胰蛋白酶溶液中，37℃孵育30 min，再冷卻至室溫，以修復(fù)抗原；PBS洗滌3次；將山羊血清滴加到組織塊上，室溫封閉30 min，根據(jù)切片上組織塊的大小加入抗體，室溫孵育2 h；PBS洗滌3次；吸取適量二抗滴加于組織切片上，37℃下反應(yīng) 40 min；PBS洗滌 3次；DAB顯色 1～4 min，根據(jù)染色情況適時終止染色；用自來水沖洗6 min；用適量蘇木精復(fù)染，隨后在PBS中返藍；將組織切片用梯度乙醇溶液處理（80%、11 s，90%、11s，100%，6 min、100%、6min），然后浸入二甲苯中處理5 min；用中性樹膠進行封片，晾干；用顯微鏡觀察并采集圖像。

組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒，則認(rèn)為該組織為陽性染色，隨機選取5個不同的視野，按照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評定。陽性細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細胞陽性百分?jǐn)?shù)為0%時，記0分；1%～29%時，記 1分；30%～65%時，記 2分；66%～100%時，記3分。陽性染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的乘積判斷表達情況，其中結(jié)果＜1時，記為0分；結(jié)果為1～3時，記為1分；結(jié)果為4或6時，記為2分；結(jié)果為9時，記為3分。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫獲取臨床樣本432個，其中包括404例膀胱癌組織樣本和28例癌旁正常組織樣本。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析ALG3的mRNA在膀胱癌組織和癌旁正常組織中的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad8.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；組間比較采用學(xué)生t檢驗；利用χ2分析臨床病理特征與蛋白表達的關(guān)系。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

ALG3在多種腫瘤中異常表達并提示不良預(yù)后。為了更好地闡明ALG3在膀胱癌中的作用，通過GPEIA分析ALG3的mRNA在膀胱癌組織和正常組織的表達情況，共分析膀胱癌組織404例及正常組織28例。結(jié)果表明，ALG3的mRNA在膀胱癌組織中顯著高表達（圖1）。為了進一步研究ALG3的表達與膀胱癌患者長期預(yù)后的關(guān)系，利用Kaplan-Meier分析了ALG3在膀胱癌患者預(yù)后中的作用。結(jié)果表明，ALG3表達較低的患者中，總生存率和無病生存率都較高（圖2A和2B）。結(jié)果提示，ALG3的表達與膀胱癌患者的生存期具有顯著的相關(guān)性，提示ALG3的異常表達可能與膀胱癌患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖 2）。

2.2 ALG3在膀胱癌組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，ALG3主要定位于胞漿，其在膀胱癌組織中高表達（圖3A），而在癌旁正常組織中ALG3的表達顯著降低（圖3B），這表明ALG3可能影響膀胱癌的生長和發(fā)展。根據(jù)染色強度，將膀胱癌患者分為ALG3高表達組和ALG3低表達組。

2.3 ALG3蛋白表達水平與膀胱患者的臨床病理特征的相關(guān)性

圖1 膀胱癌中ALG3的mRNA表達

為了闡明ALG3在膀胱癌進展中的作用，分析比較了ALG3高表達組和ALG3低表達組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)率。分析結(jié)果表明，ALG3表達水平與腫瘤分期（P＜0.05）和腫瘤復(fù)發(fā)（P＜0.05）密切相關(guān)，而與年齡（P＞0.05）、性別（P＞0.05）、腫瘤分級（P＞0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＞0.05）無顯著相關(guān)性。（表1）

3 討論和結(jié)論

圖2 ALG3表達與膀胱癌患者生存率的相關(guān)性

圖3 膀胱癌腫瘤組織和癌旁健康組織中天冬酰胺連接糖基化3的免疫組化結(jié)果

表1 天冬酰胺連接糖基化3蛋白表達與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

膀胱癌是一種起源于膀胱黏膜的惡性腫瘤[15-16]，可發(fā)生在任何年齡，且發(fā)病率隨年齡的增長而上升[17]。常用的膀胱癌檢查方法有膀胱鏡、電子計算機斷層掃描、球鏡和膀胱造影[18]。目前為止，手術(shù)治療仍是膀胱癌的主要治療方法，而膀胱內(nèi)治療通常為輔助治療手段[19-20]。接受手術(shù)治療的膀胱癌患者預(yù)后差、5年生存率低、復(fù)發(fā)率高、生活質(zhì)量差。近年來，核基質(zhì)蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）、G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptor 158，GPR158）、GPR25等新治療靶點被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[21-22]，但其功能有待進一步驗證。有研究者發(fā)現(xiàn)，ALG3在頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）、乳腺癌等多種癌癥中顯著表達，提示ALG3很可能在許多癌癥中高表達。還有研究者對ALG3在乳腺癌中的表達特征進行了研究，且證明了ALG3在乳腺癌組織中的高表達，且提示不良預(yù)后[11-12]。

以往的研究結(jié)果表明，ALG3參與了多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。ALG3是3q27擴增的一個新的生物標(biāo)志物，在食管鱗癌、宮頸癌和乳腺癌中高表達，尤其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達更為明顯[23]。有報道顯示，ALG3的高表達與乳腺癌患者和急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者的低總生存時間顯著相關(guān)[11]。最新研究結(jié)果表明，在HNSCC組織中，ALG3的mRNA水平高表達，蛋白酪氨酸激酶F相互作用蛋白1（protein tyrosine phosphatase finteracting protein 1，PPFIA1）和 ALG3的聯(lián)合高表達與不良預(yù)后有明顯關(guān)系[12]。一項最新研究結(jié)果表明，ALG3在乳腺癌中高表達，并提示不良預(yù)后[11]。

本研究中，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中ALG3的mRNA表達水平高于正常組織，且ALG3表達較低的患者的總生存率和無病生存率都較高，但是需要進一步的研究來揭示更詳細的分子機制。另外，ALG3在膀胱癌腫瘤組織中的高表達與腫瘤分期和腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)（均P＜0.05），但與年齡、性別、腫瘤分級和淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P＞0.05）。而且，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明ALG3的表達與膀胱癌患者的長期預(yù)后存在相關(guān)性，在ALG3表達較低的患者中，總生存率和無病生存率都較高。

綜上所述，本研究有助于更好地理解和認(rèn)識ALG3與膀胱癌之間的關(guān)系，所得的研究結(jié)果提示ALG3有望成為膀胱癌重要的治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。因此，筆者下一步將更加具體、更加全面地研究ALG3在膀胱癌中的功能和作用，如通過沉默ALG3、構(gòu)建小鼠模型等方式研究ALG3對膀胱癌細胞的增殖、遷移等的影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突