基于全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜及感官分析的中法白蘭地香氣特征研究

李元一，邢可馨，張葆春，申春華，徐巖，唐柯*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)4(煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東 煙臺(tái)，264000)

白蘭地是葡萄經(jīng)過酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶儲(chǔ)藏、調(diào)配而成的葡萄蒸餾酒，位于世界六大蒸餾酒之列。而香氣則是白蘭地質(zhì)量評(píng)價(jià)中最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一，不同的香氣表現(xiàn)，反映了一款白蘭地的原料品種、風(fēng)土條件、釀造工藝等，其決定著白蘭地的風(fēng)格和典型性，所以探究產(chǎn)區(qū)白蘭地的香氣特征一直是白蘭地風(fēng)味研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。法國[1-3]、德國[4]等國家地區(qū)已經(jīng)對(duì)其白蘭地的香氣特征有了較為深入的研究與分析，而國內(nèi)對(duì)白蘭地香氣特征的研究近年來也逐漸開展，但是研究大都集中在檢測方法的優(yōu)化[5-6]和成分分析方面[7-8]，我國白蘭地區(qū)別于其他國家地區(qū)白蘭地的典型特征香氣尚未明晰。

目前，風(fēng)味研究主要包括儀器和感官分析2個(gè)方面。在香氣的儀器分析中，一維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)是最常見的檢測分析方法，而隨著全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，相比于普通的一維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，其有著高峰容量、高靈敏度、檢測物質(zhì)多等優(yōu)點(diǎn)[9]。對(duì)于一些在一維色譜柱上通常會(huì)共流出的化合物，可以通過第二根柱子進(jìn)行再次分離，從而大大改善了峰掩映的問題，目前已廣泛應(yīng)用于酒類香氣的研究中。如WELKE等[10]用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(headspace solid-phase microextraction with comprehsive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectromtry，HS-SPME-GC×GC-TOFMS)鑒別了霞多麗葡萄酒中243種揮發(fā)性化合物，同時(shí)測定了揮發(fā)性化合物的氣味活度值和相對(duì)氣味貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和β-大馬酮與其他43種化合物對(duì)葡萄酒香氣具有較大的貢獻(xiàn)潛力；陳雙等[11]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在芝麻香型白酒中解析了340種揮發(fā)性化合物并首次鑒定11種硫化物和12種萜烯類化合物，對(duì)芝麻香型白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)和生理功能的都具有重要意義；張小倩等[12]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS比較了4種不同酵母發(fā)酵的冰葡萄酒中的揮發(fā)性化合物，共解析了156種香氣成分，發(fā)現(xiàn)不同的酵母對(duì)不同種類化合物的代謝具有明顯的差異。

感官評(píng)價(jià)方面，定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)是一種常見的分析方法，其使用一個(gè)經(jīng)過高度訓(xùn)練的評(píng)價(jià)小組來描述和量化某個(gè)產(chǎn)品或者某類產(chǎn)品的感官屬性，可以很好的表征產(chǎn)品的特征和屬性強(qiáng)度[13]。但是由于時(shí)間和人力成本的提高，越來越多的感官實(shí)驗(yàn)趨向于簡單，快速，準(zhǔn)確的感官分析方法[14]。Napping?是一種根據(jù)產(chǎn)品相似性對(duì)其進(jìn)行擺放的快速感官分析方法，最早應(yīng)用于葡萄酒的感官實(shí)驗(yàn)中[15]。相比較于QDA，Napping?節(jié)省了大量的時(shí)間和人力，可以快速獲得產(chǎn)品的特定感官屬性信息和關(guān)鍵特征的描述概況[16]。如OLIVER等[17]對(duì)草莓進(jìn)行感官測評(píng)，對(duì)比了Napping?與QDA之間的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)Napping?結(jié)合Ultra Flash Profiling (UFP)，可以達(dá)到QDA的近似效果，2種感官分析方法得到的結(jié)果具有很好的一致性。

本研究以中國煙臺(tái)地區(qū)和法國干邑地區(qū)的白蘭地為研究對(duì)象，通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS儀器分析和Napping?感官分析相結(jié)合，探究不同產(chǎn)區(qū)白蘭地的香氣特征。研究不僅可以豐富我國白蘭地的風(fēng)味化學(xué)理論體系，同時(shí)對(duì)于進(jìn)一步調(diào)控我國白蘭地的生產(chǎn)也提供重要的風(fēng)味導(dǎo)向依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

實(shí)驗(yàn)選取了9款白蘭地作為樣品，均由煙臺(tái)張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司提供。具體信息如表1所示。

表1 白蘭地樣品信息Table 1 Brandy sample information

1.1.2 試劑

NaCl(分析純)，上海國藥集團(tuán)；C7～C30直鏈正構(gòu)烷烴、4-甲基-2-戊醇(色譜純)，Sigma-Aldrich；超純水。

1.1.3 感官實(shí)驗(yàn)材料

40 cm×60 cm的白紙，鉛筆，橡皮，上海晨光文具股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

純水儀，美國Millipore公司；Agilent 7890B 氣相色譜，一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent公司；KT-2001冷噴調(diào)制器，美國Zoex公司；Pegasus?4D 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國Leco公司；DVB/CAR/PDMS三相萃取頭(2 cm 50/30 μm)，美國Supelco公司；MPS2多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，德國Gerstel公司；二維色譜柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Restek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析

1.3.1.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)方法

取0.5 mL白蘭地樣品，4.5 mL超純水置于20 mL頂空樣品瓶中，加入1.5 g NaCl，10 μL 4-甲基-2-戊醇(質(zhì)量濃度為103.4 mg/L)作為內(nèi)標(biāo)[3]，由MPS2系統(tǒng)進(jìn)行HS-SPME自動(dòng)進(jìn)樣。參考實(shí)驗(yàn)室之前建立的方法并加以改進(jìn)，萃取溫度50 ℃，樣品平衡5 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速為400 r/min。萃取結(jié)束后，將萃取頭置于GC進(jìn)樣口，在250 ℃下解析附5 min，不分流進(jìn)樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.1.2 全二維飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)方法

參考實(shí)驗(yàn)室之前建立的方法并做優(yōu)化[18]。GC×GC條件：起始溫度45 ℃保持3 min后，以4 ℃/min升溫至150 ℃并保持2 min;以6 ℃/min升溫至200 ℃，然后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。第2個(gè)烘箱的溫度全程保持比一維烘箱高5 ℃。調(diào)制補(bǔ)償溫度為20 ℃，調(diào)制周期為4 s(熱脈沖時(shí)間 0.8 s)。樣品運(yùn)行采用恒流模式，載氣為高純He(純度>99.999 5%)，流速為1 mL/min。

TOFMS條件：離子源電壓為70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，檢測器電壓為1 430 V，采集質(zhì)量數(shù)為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。

1.3.2 感官分析

1.3.2.1 感官小組的建立與培訓(xùn)

實(shí)驗(yàn)采用自愿報(bào)名的方式進(jìn)行品評(píng)員的招募，通過填寫問卷的形式，對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)(無吸煙史，無過敏史，身體健康，有空余時(shí)間)的67人進(jìn)行基本嗅覺及味覺等感官靈敏度測試，篩選出24人。對(duì)選出的24人進(jìn)行為期1個(gè)月(每周1次)的基本感官培訓(xùn)，通過香氣識(shí)別檢驗(yàn)、差別檢驗(yàn)、分類標(biāo)尺使用檢驗(yàn)，復(fù)篩出15人組成感官小組。對(duì)感官小組的15名品評(píng)員進(jìn)行為期3個(gè)月(每周1次)定期針對(duì)性培訓(xùn)，最終通過香氣辨別能力及描述測試，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前要讓品評(píng)員熟悉樣品，并了解Napping?及UFP的實(shí)驗(yàn)方法。

1.3.2.2 Napping?

將9個(gè)白蘭地樣品放入品評(píng)杯中并標(biāo)注3位隨機(jī)編碼，一次性提供給感官小組品評(píng)員。品評(píng)員要根據(jù)酒樣香氣特征的相似性及差異性，將樣品放置在40 cm×60 cm的白紙上進(jìn)行擺放。樣品間的擺放距離越近，表明樣品的相似度越高；樣品間的擺放距離越遠(yuǎn)，表明樣品間的差異性越大。當(dāng)全部酒樣擺放完成后，再將樣品的對(duì)應(yīng)位置標(biāo)記圓點(diǎn)，并標(biāo)注樣品編號(hào)。以白紙的長和寬作為橫軸和縱軸，統(tǒng)計(jì)樣品位置的坐標(biāo)信息。

1.3.2.3 Ultra Flash Profiling (UFP)

在品評(píng)員完成Napping?后，要求其在每個(gè)樣品的對(duì)應(yīng)位置旁邊寫出3～5個(gè)具有特征性和典型性的香氣描述詞。對(duì)每個(gè)樣品香氣特征描述詞進(jìn)行歸類并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 GC×GC-TOFMS數(shù)據(jù)處理

白蘭地中揮發(fā)性化合物的定性：用LECO公司軟件ChromaTOF處理試驗(yàn)采集的數(shù)據(jù)。自動(dòng)識(shí)別信噪比(S/N)>200的色譜峰，然后進(jìn)行自動(dòng)解卷積和質(zhì)譜庫(NIST 2014和Wiley 9)比對(duì)。運(yùn)用軟件的數(shù)據(jù)比較功能(statistical comparison)自動(dòng)匹配相似度(similarity)≥800且3個(gè)平行樣品中至少出現(xiàn)2次的峰作為該酒樣中存在的組分。系統(tǒng)通過同條件下進(jìn)樣的正構(gòu)烷烴(C7～C30)和樣品中化合物的出峰時(shí)間，自動(dòng)計(jì)算每個(gè)化合物的保留指數(shù)(retention index，RI)，經(jīng)過文獻(xiàn)比對(duì)，篩選RI相差30的化合物作為最終的定性結(jié)果。

白蘭地中揮發(fā)性化合物的半定量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的單位為μg/L。

1.4.2 感官實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用 R 語言 3.4.3 進(jìn)行普氏多維向量分析(procrustes multiple factor analysis，PMFA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC×GC-TOFMS分析

2.1.1 白蘭地?fù)]發(fā)性化合物組分分析

通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析，在中國和法國白蘭地中共鑒別出512種揮發(fā)性化合物(表2)。其中酯類化合物占21.88%，是鑒別出來的數(shù)量最多的一類化合物，也與之前的研究結(jié)果相一致[6]。其次是醇類、芳香族和羰基類化合物，分別占15.04%、16.80%、16.21%。

表2 中法白蘭地HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鑒定的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds identified in Chinses and French brandies by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

醇類是白蘭地中一類很重要的香氣化合物，主要生成于白蘭地的第1次蒸餾過程[2]，表現(xiàn)為果香和花香，可以給酒帶來積極的香氣特征。而含硫化合物的種類較少，這是由白蘭地特殊的生產(chǎn)工藝決定的。其在發(fā)酵前不能添加SO2，并且在大多數(shù)的白蘭地生產(chǎn)時(shí)采用銅制的壺式蒸餾器，銅離子可以與硫化物發(fā)生反應(yīng)，因此2次蒸餾后，酒中硫化物會(huì)大大減少[19]。

2.1.2 白蘭地?fù)]發(fā)性香氣組分分析

在所有樣品中定性出的揮發(fā)性化合物中，并非都具有香氣特征，風(fēng)味的研究則更關(guān)注具有香氣特征的化合物。因此對(duì)于已經(jīng)定性的數(shù)據(jù)，又通過Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2個(gè)香氣數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，最終鎖定157種具有香氣特征地?fù)]發(fā)性化合物進(jìn)行半定量計(jì)算，進(jìn)一步采用單因素方差分析，篩選42種具有顯著差異(P≤0.05)的香氣化合物，制作熱圖(圖1)。熱圖分析結(jié)果可以看出，中國煙臺(tái)的白蘭地較好的聚為一類，法國干邑的白蘭地聚為一類，并且法國干邑地區(qū)3款VSOP單獨(dú)聚為一類，3款XO單獨(dú)聚為一類，中法白蘭地根據(jù)化合物的種類和含量具有較為明顯的產(chǎn)地及等級(jí)特征性。

此外，熱圖可以將化合物的含量通過顏色的變化直觀展現(xiàn)出來。由圖1可知，組分A是中國張?jiān)０滋m地中質(zhì)量濃度含量較高的化合物，主要是酯類和萜烯類化合物。酯類物質(zhì)主要表現(xiàn)為水果香、花香，如庚酸乙酯，丙酸乙酯，壬酸甲酯等。萜烯類化合物主要來源于葡萄果實(shí)[20]，橙花醇表現(xiàn)為花香，黃樟醚表現(xiàn)為甜香，而松油醇，β-松油醇則表現(xiàn)為松柏，肉豆蔻的香氣。組分B是法國6款白蘭地中質(zhì)量濃度較高的化合物。其中庚酸以蘑菇和生青味為香氣特征，MALFONDET等[21]也曾解析出該化合物為法國白蘭地中比較重要的香氣成分。組分C是張?jiān)O級(jí)別白蘭地中濃度含量較高的化合物。其中丁子香酚是橡木桶陳釀的典型產(chǎn)物之一，具有丁香和香料的特征香氣，隨著陳釀時(shí)間的增加，丁子香酚在酒樣中的含量也逐漸增加[22]。丁子香酚在相同品牌下XO級(jí)別的白蘭地比VSOP級(jí)別的白蘭地含量明顯要高，這一結(jié)果也與前人研究的結(jié)果相一致[22]。

圖1 中法白蘭地的顯著性差異香氣組分熱圖分析和HCA聚類分析Fig.1 Heat map and hierarchical clustering analysis(HCA) of aroma compounds with a significant difference in Chinese and French brandies

2.2 感官分析

Napping?作為最早應(yīng)用于葡萄酒中的快速感官分析方法，也被應(yīng)用于白蘭地的感官之中。LOUW等[25]采用Napping?，對(duì)白蘭地視覺、前鼻香和口腔感覺(包括基本味覺、口感和后鼻嗅)這3種特征進(jìn)行評(píng)估和測試，發(fā)現(xiàn)顏色和后鼻嗅的感知與否對(duì)小組成員在味覺和口感中的評(píng)估并無影響，同時(shí)成功地捕捉白蘭地之間的口感差異，也為后面白蘭地的Napping?感官研究提供了更多的科學(xué)依據(jù)。

為深入探究中法白蘭地的香氣特征的差異，本文采用快速感官分析方法Napping?進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在感官數(shù)據(jù)收集整理后，采用R語言的PMFA算法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別生成評(píng)價(jià)小組對(duì)產(chǎn)品的聚類特征圖和香氣特征相關(guān)性圖。由圖2可知，中國與法國白蘭地明顯分為2類，中國煙臺(tái)的3款白蘭地單獨(dú)聚為一類，主要集中在第4象限；法國干邑的白蘭地則聚為一類。其中香料、焦糖、干果、奶油為中國煙臺(tái)白蘭地區(qū)別于法國干邑白蘭地的主要香氣特征。

a-香氣特征相關(guān)性圖；b-聚類特征圖圖2 中法白蘭地Napping?結(jié)合 UFP 的普氏向量分析Fig.2 Procrustes multiple factor analysis of Napping? with UFP between French and Chinese brandies

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析中國煙臺(tái)地區(qū)和法國干邑地區(qū)的9種白蘭地，共鑒定出512種揮發(fā)性化合物，其中酯類化合物種類最多。通過香氣數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選后經(jīng)過熱圖分析，結(jié)果表明根據(jù)香氣組分種類和含量差異，可以明顯區(qū)分中國和法國的白蘭地。Napping?結(jié)合UFP感官分析結(jié)果可以看出，香料、焦糖、干果、奶油是中國煙臺(tái)白蘭地區(qū)別于法國干邑地區(qū)的主要香氣特征。本研究豐富了我國白蘭地的風(fēng)味化學(xué)理論體系，也為進(jìn)一步開展我國白蘭地的風(fēng)味研究提供借鑒依據(jù)。