基于Illumina MiSeq分析貴州凱里酸湯獨特風(fēng)味的優(yōu)勢菌群

王琪琪，田界先，潘宗東，杜靜，辛健康，張傳博*

1(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州千里苗疆農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，貴州 凱里，556000) 3(黔東南州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 凱里，556000)

酸湯是貴州黔東南苗族、侗族人民嗜食的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，包括白酸湯和紅酸湯兩種，成品紅酸湯由辣椒紅酸湯、番茄紅酸湯分別發(fā)酵、混合而成。白酸湯的主要原材料有大米、糯米、玉米等，做法是將清米湯直接放置在密閉容器內(nèi)，接種老酸湯，自然發(fā)酵。白酸湯具有開胃健脾、增進(jìn)食欲、生津止渴、清熱解暑、助消化等保健功效。白酸湯中添加蔬菜，煮制菜湯，是當(dāng)?shù)厝说娜粘ｏ嬍沉?xí)慣，當(dāng)?shù)赜小叭觳怀运?，走路打串串”之說。此外，白酸湯可加工成火鍋底料、調(diào)味品、飲料等[1]。

紅酸湯的主要原材料為番茄、辣椒。制作工藝可分為兩個發(fā)酵階段：一是番茄和辣椒分別發(fā)酵為半成品；二是將兩者按一定的比例混合進(jìn)行第2次發(fā)酵。第1個階段決定了紅酸湯的酸度，是紅酸湯風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段[2]。紅酸湯、白酸湯可以作為底料配以蔬菜，牛肉、鮮魚、排骨等制成酸湯火鍋。酸湯中富含多種益生菌群和有機(jī)酸、礦物質(zhì)等，有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡、幫助消化、防止便秘、防止細(xì)胞老化、降低膽固醇以及調(diào)劑人體生理機(jī)能等保健作用[3]。

苗家酸湯含有一定量的酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和少量的丁二酸。富含豐富的礦物質(zhì)，如鈣、磷、鐵等對保持神經(jīng)、肌肉的興奮性以及維持肌體的酸堿平衡具有重要的作用[4]。酸湯發(fā)酵中主要有乳酸桿菌、醋酸桿菌、雙歧桿菌和酵母菌等多種微生物，發(fā)酵階段的微生物是酸湯品質(zhì)風(fēng)味形成的重要因素。自然發(fā)酵的酸湯品質(zhì)極不穩(wěn)定[5]。

目前，對于酸湯的報道大多為單個白酸湯、辣椒紅酸湯、番茄紅酸湯的研究。如紅酸湯的發(fā)酵工藝；主要營養(yǎng)成分和功能成分的分析研究[6]；苗族發(fā)酵型白酸湯的生產(chǎn)工藝研究；凱里白酸湯的工藝優(yōu)化；苗族白酸湯飲料的開發(fā)；貴州紅酸湯火鍋調(diào)料的研究進(jìn)展及工業(yè)化進(jìn)程等。

運(yùn)用高通量測序(Illumina MiSeq)技術(shù)分析貴州凱里酸湯獨特風(fēng)味的優(yōu)勢菌群尚無相關(guān)報道。在酸湯中接種老酸湯發(fā)酵時，可能存在老酸湯質(zhì)量問題和接種時操作規(guī)范問題。由于發(fā)酵過程為自然發(fā)酵，最終形成的品質(zhì)風(fēng)味受外界環(huán)境影響巨大。因此，揭示酸湯發(fā)酵過程中的微生物多樣性優(yōu)勢菌群種類對酸湯生產(chǎn)具有重大意義。因此對貴州黔東南酸湯的研究解釋有助于白酸湯和紅酸湯發(fā)酵過程的精準(zhǔn)調(diào)控，指導(dǎo)大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯，采自貴州千里苗疆農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司的9個不同車間，采集樣品后將其裝入密封器皿中，低溫運(yùn)輸至實驗室，放于4 ℃短期存放，提取樣品總DNA。

1.2 總DNA抽提

1.2.1 試劑盒提取樣品DNA

量取100 mL白酸湯，100 mL辣椒紅酸湯和100 mL番茄紅酸湯，4 000 r/min離心5 min后棄上清取沉淀，采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒，按照試劑盒操作說明書進(jìn)行微生物總DNA 提取。

1.2.2 預(yù)洗處理的聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)法

稱取2.0 g已處理樣品于10 mL離心管內(nèi)，按照PVP法提取樣品總DNA[7]。

將2種方法提取的基因組DNA按比例混合，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，并根據(jù)測序得到的數(shù)據(jù)使用分析軟件進(jìn)行各項指標(biāo)分析。

1.3 引物及PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測與純化

16S rRNA基因V3～V4區(qū)擴(kuò)展引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)[8-9]；ITS區(qū)引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[10]。PCR正式試驗采用TransStart FastPfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系為：5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，正、反向引物(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase (2.5 U/μL) 0.4 μL，BSA (0.8 μg/μL) 0.2 μL，DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測與純化

PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后，再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收。

1.5 熒光定量、文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

參照電泳結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFLuorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(PRomega公司)進(jìn)行檢測定量。參照沈馨等[11]方法,將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer (Promega, USA) 對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，文庫合格后，進(jìn)行上機(jī)測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)存在一定比例的干擾，為了得到更加準(zhǔn)確、可靠的信息分析結(jié)果，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾處理得到有效數(shù)據(jù)(clean data)?；谟行?shù)據(jù)采用 Usearch 軟件進(jìn)行OTUs (operational taxonomic units) 聚類和物種分析。根據(jù)OTUs聚類分析及各個分類水平下的物種比對結(jié)果，利用QIIME軟件對每個OTU的代表序列進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，基于分類學(xué)信息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析[12]。采用 Sliva 細(xì)菌數(shù)據(jù)庫比對細(xì)菌得到的OTU代表序列, 采用Unite真菌數(shù)據(jù)庫比對真菌得到的OTU代表序列。進(jìn)行物種注釋分析，獲得對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

同時，對OTUs進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計、Beta多樣性、群落結(jié)構(gòu)、群落熱圖等分析。從而得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度等信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息以及Beta多樣性指數(shù)組間差異分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及Alpha多樣性統(tǒng)計

用Ace和Chao指數(shù)來評估菌群豐富度，Ace指數(shù)顯示的細(xì)菌物種豐度為番茄紅酸湯>辣椒紅酸湯>白酸湯，真菌物種豐富度為辣椒紅酸湯>白酸湯>番茄紅酸湯；Chao指數(shù)顯示的細(xì)菌物種豐富度為番茄紅酸湯>辣椒紅酸湯>白酸湯，真菌物種豐富度為辣椒紅酸湯>白酸湯>番茄紅酸湯(表1)。Shannon和Simpson指數(shù)評估群落多樣性，Shannon指數(shù)指示的細(xì)菌群落多樣性為番茄紅酸湯>白酸湯>辣椒紅酸湯，真菌群落多樣性為辣椒紅酸湯>番茄紅酸湯>白酸湯；Simpson指數(shù)指示的細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為番茄紅酸湯>白酸湯>辣椒紅酸湯，真菌群落多樣性表現(xiàn)為辣椒紅酸湯>番茄紅酸湯>白酸湯(表1)。上述8組數(shù)據(jù)顯示,紅酸湯的細(xì)菌群落多樣性>白酸湯，紅酸湯的真菌群落多樣性>白酸湯。

表1 OTU聚類與多樣性分析Table 1 cluster and diversity analysis of OTU

2.2 樣品間Beta多樣性指數(shù)分析

為了評價微生物β多樣性，對傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵的白酸湯、辣椒紅酸湯、番茄紅酸湯進(jìn)行種水平上的樣本層級聚類分析，主要反映了發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的總體差異。兩樣品越接近，它們之間的種就越相似，根據(jù)距離遠(yuǎn)近進(jìn)行分析， 白酸湯、辣椒紅酸湯、番茄紅酸湯細(xì)菌菌群明顯的分為3個簇，呈鮮明的差異性(圖1-a)，白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯真菌菌群具有明顯的差異性，但是辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯沒有明顯的差異性(圖1-b)。

a-細(xì)菌層級聚類;b-真菌層級聚類圖1 樣本種水平上的層級聚類Fig.1 Hierarchical clustering analysis at the species level of sample注：BST為白酸湯；HSTC為辣椒紅酸湯；HSTL為番茄紅酸湯(下同)

2.3 OTU聚類、注釋及多樣性分析

白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯通過測序共獲得173個細(xì)菌OTUs(圖2-a)。其中白酸湯特有細(xì)菌菌種1個；辣椒紅酸湯特有菌種32個；番茄紅酸湯特有菌種49個。白酸湯，辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯共有菌種21個；白酸湯和辣椒紅酸湯共有菌種3個；白酸湯和番茄紅酸湯共有菌種2個；辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯共有菌種50個。

白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯通過測序共獲得99個真菌OTUs(圖2-b)。白酸湯特有菌種13個；辣椒紅酸湯特有菌種41個；番茄紅酸湯特有菌種有2個。白酸湯，辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯共有菌種13個；白酸湯和辣椒紅酸湯共有菌種21個; 白酸湯和番茄紅酸湯共有菌種2個；辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯共有菌種7個。

a-細(xì)菌Venn圖;b-真菌Venn圖圖2 樣品種水平Venn圖Fig.2 VENN analyies at the species level of sample

2.4 群落結(jié)構(gòu)組分分析

2.4.1 門和屬水平上群落結(jié)構(gòu)組分分析

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，白酸湯細(xì)菌檢測到4個門(Phylum)，分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。分別為微小桿菌屬(Exiguobacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、葡萄醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)等19個屬(Genus)，30個OTUs；真菌有4個門(Phylum)、分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)等。39個屬(Genus)，分別為青霉屬(Penicillium)、籃狀菌屬(Talaromyces)、Nigrospora、Meyerozyma、鏈格孢屬(Alternaria)等89個OTUs。

辣椒紅酸湯細(xì)菌檢測到9個細(xì)菌門(Phylum)，分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)等。71個屬，分別為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、布氏桿菌屬(Bryobacter)、葡萄糖醋酸桿菌(Gluconacetobacter)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、酸丙酸桿菌(Acidipropionibacterium)等，120個OTUs；真菌有4個門(Phylum)，分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)等。60個屬，分別為籃狀菌屬(Talaromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、Cyberlindnera、Meyerozyma、Cystofilobasidium、鏈格孢屬(Alternaria)等，127個OTUs。

番茄紅酸湯檢測到8個細(xì)菌門(Phylum)，分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)等。88個屬，分別為Sinomicrobium、擬桿菌屬(Bacteroides)、嗜熱菌屬(Anoxybacillus)、Rosenbergiella、海細(xì)菌屬(Marinobacterium)、Dysgonomonas、海桿菌屬(Marinobacter)等，136個OTUs；真菌有4個門(Phylum)分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、絲孢菌門(Mortierellomycota)等。26個屬，分別為Hanseniaspora、Saitozyma、畢赤酵母屬(Pichia)、哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、雙足囊菌屬(Dipodascus)，Plectosphaerella，假絲酵母(Candida)等，45個OTUs。

2.4.2 種水平上群落結(jié)構(gòu)組分分析

白酸湯的細(xì)菌優(yōu)勢菌種為43.46%Lactobacillusharbinensis、31.25%布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、10.05%干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、9.90%unclassified_g_Acetobacter、1.79%植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)、1.39%液化葡萄糖醋酸桿菌(Gluconacetobacterliquefaciens)、1.38%發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)；辣椒紅酸湯的細(xì)菌優(yōu)勢菌種為76.25%耐酸乳酸菌(Lactobacillusacetotolerans)、7.35%耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)、6.03%布氏乳桿菌(L.buchneri)、2.95%面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)、1.81%uncultured_bacterium_g_Lactobacillus、1.23%未分類的乳酸桿菌(unclassified_g_Lactobacillus)、1.19%unclassified_g_norank_o_Chloroplast、0.74%uncultured_Lactobacillus_p_g_Lactobacillus、0.55%植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)；番茄紅酸湯的細(xì)菌優(yōu)勢菌種為33.38%Lactobacilluszymae、31.18%布氏乳桿菌(L.buchneri)、14.82%耐酸乳酸菌(L.acetotolerans)、9.99%unclassified_g_norank_o_Chloroplast、2.09%耐乙醇片球菌(P.ethanolidurans)、1.73%面包乳桿菌(L.panis)、1.33%類短乳酸菌(Lactobacillusparabrevis)、1.23%未分類的乳酸桿菌(unclassified_g_Lactobacillus)、1.18%uncultured_Lactobacillus_sp._g_Lactobacillus、1.08%植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)、0.87%uncultured_bacterium_g_Lactobacillus(圖3-a)。

白酸湯在種水平的優(yōu)勢真菌分別為88.31%膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)、6.39%博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、2.86%未分類的子囊菌門(unclassified_p_Ascomycota)、0.95%地絲雙足囊菌(Dipodascusgeotrichum)；辣椒紅酸湯在種水平上的優(yōu)勢真菌為74.36%Kazachstaniahumilis、19.02%釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、2.13%地絲雙足囊菌(D.geotrichum)、0.96%unclassified_p_Ascomycota、0.84%膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)；番茄紅酸湯在種水平上的優(yōu)勢真菌為99.17%K.humilis、0.32%膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)(圖3-b)。

a-細(xì)菌的組成情況;b-真菌的組成情況圖3 樣品種水平上的組成情況Fig.3 Composition at the species level of sample

2.5 Heatmap熱圖分析

通過對白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯豐度排名前35的物種進(jìn)行熱圖分析，反映白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯在屬水平上群落組成的相似性和差異性。白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯細(xì)菌在屬水平豐度不同，但主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)5個門中。白酸湯優(yōu)勢菌屬為葡萄糖醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等；辣椒紅酸湯優(yōu)勢菌屬為片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏屬(Weissella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、奈瑟菌屬(Neisseria)等；番茄紅酸湯優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、青枯菌屬(Ralstonia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)等(圖4-a)。

白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯真菌在屬水平豐度不同，但主要分布在子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)4個門中。白酸湯的優(yōu)勢菌屬為畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、雙足囊菌屬(Dipodascus)、青霉菌屬(Penicillium)；辣椒紅酸湯的優(yōu)勢菌屬為分子孢子菌屬(Cladosporium)、Kodamaea、針殼孢屬(Septoria)等；番茄紅酸湯的優(yōu)勢菌屬為Kazachstania、畢赤酵母屬(Pichia)、雙足囊菌屬(Dipodascus)、小囊菌屬(Microascus)(圖4-b)。

a-細(xì)菌相對豐度熱圖;b-真菌相對豐度熱圖圖4 樣本屬水平上的相對豐度熱圖Fig.4 Relative abundance heatmap at the genus level of sample

2.6 樣本與物種的關(guān)系

白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的第一優(yōu)勢菌屬均為乳酸菌屬(Lactobacillus)，第二優(yōu)勢菌屬為醋酸桿菌屬(Acetobacter)、葡萄糖醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)、雙球菌屬(Pediococcus)、norank_o_Chloroplast，且在辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯中的平均豐度比白酸湯中高(圖5-a)。

白酸湯的優(yōu)勢真菌菌屬為畢赤酵母屬(Pichia)和假絲酵母屬(Candida)。辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的優(yōu)勢菌屬為哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、酵母屬(Saccharomyces)。白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的共有菌屬為未分類的子囊菌門(unclassified_p_Ascomycota)、雙足囊菌屬(Dipodascus)，且unclassified_p_Ascomycota在白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯中的平均豐度依次為74%、25%、1.0%；Dipodascus在白酸湯、辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯中的平均豐度依次為29%、65%、6.3%(圖5-b)。

a-細(xì)菌Circos圖;b-真菌Circos圖圖5 樣本在屬水平上的Circos圖Fig.5 Circos at the genus level of sample

3 討論

酸湯獨特風(fēng)味的形成與微生物發(fā)酵緊密相關(guān)。酸湯的微生物發(fā)酵作用以乳酸為主并伴有少量的酒精發(fā)酵和微量的醋酸發(fā)酵。白酸湯和辣椒紅酸湯、番茄紅酸湯的微生物優(yōu)勢菌屬不同。白酸湯是將大米、糯米、鮮玉米煮成米湯，接種老酸湯密封發(fā)酵而成；紅酸湯是將辣椒、番茄處理干凈，剁成醬，分別加入適量的糯米湯、食鹽、白酒、木姜子進(jìn)行密封發(fā)酵而成。推測造成白酸湯和紅酸湯菌落結(jié)構(gòu)差異的主要原因是老酸湯中微生物以及在接種老酸湯時帶入的環(huán)境微生物，辣椒和番茄表面附著微生物及其內(nèi)生菌。有機(jī)酸是決定發(fā)酵食品風(fēng)味的因素之一。蔬菜本身帶有有機(jī)酸，發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生有機(jī)酸，不同的蔬菜，有機(jī)酸種類和含量也不同[13]。不同的有機(jī)酸形成的口感風(fēng)味不同。

白酸湯，辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的共同菌種有植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)。植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)在酸湯發(fā)酵時使其品質(zhì)穩(wěn)定、口味上乘、開胃爽口并且減短發(fā)酵周期。植物乳桿菌在干酪成熟過程中起到重要作用，能提高干酪中的游離氨基酸(free amino acid, FAA)含量，其是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體[14]，從而增強(qiáng)干酪的風(fēng)味[15]。AGUILAR-TOAL等發(fā)現(xiàn)從植物乳桿菌發(fā)酵的發(fā)酵乳中提取的肽碎片具有抗感染、抗溶血、抗氧化的功能，其中<3 kDa的肽碎片具有更高活性[16]。ZAGO等研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌(L.plantarumsubsp. plantarum)能產(chǎn)生葉酸、核黃素，且在發(fā)酵乳中具有較好的抗氧化能力[17]。白酸湯中的優(yōu)勢真菌膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)是一種生防酵母，膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)的大量繁殖會使發(fā)酵食品表面生花，長白膜，產(chǎn)生不愉快的酸臭味，導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)，氧化酵母能利用乳酸和較低的鹽水，而致使其他腐敗菌生長，但這只在有氧條件下才發(fā)生[18]。推測造成白酸湯中有膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)的原因是白酸湯發(fā)酵時老酸湯接種不當(dāng)或者厭氧發(fā)酵環(huán)境不好。因此，在后期的生產(chǎn)中應(yīng)該嚴(yán)格把控老酸湯質(zhì)量和厭氧發(fā)酵環(huán)境。白酸湯中的膜璞畢赤酵母(P.membranifaciens)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)是形成其風(fēng)味的主要微生物。辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的優(yōu)勢菌屬大致相似，但其相對豐度不同，因此推測形成差異的主要原因在于原材料的內(nèi)生菌差異。辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯中的耐酸乳酸菌(L.acetotoleran)和K.humilis是形成紅酸風(fēng)味特征的主要菌群。耐酸乳酸菌(L.acetotoleran)在酸湯發(fā)酵時可以抑制雜菌的生成但是發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)過程中，耐酸乳酸菌(L.acetotoleran)能夠?qū)⑵咸烟堑鹊孜镛D(zhuǎn)化為醋酸和乳酸，豐富醋的風(fēng)味。一旦其出現(xiàn)在成品醋中就會引起醋的變質(zhì)和腐敗[19]。K.humilis會增加食品的體外抗氧化活性，而且能提高油炸面團(tuán)游離氨基酸總量[20]。

白酸湯中特有微生物有液化葡糖醋酸桿菌(G.liquefaciens)、哈爾濱乳桿菌(L.harbinensis)、干酪乳桿菌(L.casei)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)。液化葡糖醋酸桿菌(G.liquefaciens)產(chǎn)生醋酸，使得白酸湯酸爽可口，可以和發(fā)酵環(huán)境中的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，產(chǎn)生酯類化合物乙酸乙酯，具有芳香氣味，賦予酸湯獨特的香氣。但醋酸含量過高也會影響酸湯成品的品質(zhì)。因此，在發(fā)酵過程中要始終保持好的厭氧環(huán)境，缺氧狀態(tài)可以抑制醋酸菌的生長代謝活動，以保障酸湯的風(fēng)味品質(zhì)。發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)作為異型發(fā)酵乳酸菌,常被用于傳統(tǒng)谷物類食品的發(fā)酵生產(chǎn)[21]。如在發(fā)酵豆乳應(yīng)用,可消除豆乳中脹氣因子α-半乳糖苷類低聚糖的含量[22]。在對不同發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)菌株的生理特征研究時發(fā)現(xiàn),很多菌株都具備益生菌的優(yōu)良特性[23-26]。由于發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)具有耐受腸道環(huán)境的能力,因此還能在動物腸道中起到原位殺菌或抑菌的效果。干酪乳桿菌(L.casei)具有良好的耐酸及膽汁抗性,可降低血漿膽固醇,增強(qiáng)宿主對微生物病原體的非特異性抵抗力,加快清除腸道內(nèi)病原體,治療腸道菌群紊亂和增強(qiáng)腸道透性,從而防止食物過敏和急性腹瀉。此外,干酪乳桿菌(L.casei)還可使抗低密度氧化脂抗體和淋巴細(xì)胞增加,使粒細(xì)胞的噬菌作用明顯增強(qiáng),對宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié),防止腫瘤的產(chǎn)生[27]。博伊丁假絲酵母(C.boidinii)屬于產(chǎn)酯酵母，使得白酸湯有獨特的香味。辣椒紅酸湯中特有的微生物為釀酒酵母(S.cerevisiae)，酵母菌通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生酒精，既可以增加醇香，也可以抑制有害菌生長，還可以進(jìn)一步與有機(jī)酸反應(yīng)產(chǎn)生酯類等芳香成分，使發(fā)酵食品的風(fēng)味更加豐富[28]。此外，酵母菌的代謝產(chǎn)物有利于乳酸菌的生長[29-32]。釀酒酵母(S.cerevisiae)能夠阻止其pH進(jìn)一步下降，降低總酸生成量，可有效解決辣椒紅酸湯的過度酸化。番茄紅酸湯中特有的微生物為L.zymae、Lactobacillusparabrevis。L.zymae在食品中發(fā)酵時會產(chǎn)生γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)。GABA是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于微生物、植物和動物中。在微生物中，GABA增加耐酸能力和ATP的產(chǎn)生[33]。它是一種神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，在動物中具有多種重要的生理功能，包括降壓、抗焦慮、通便、鎮(zhèn)痛和利尿等[34]。因此含有L.zymae的藥物或食品具有很好的開發(fā)價值。