不同pH和離子強度條件下青魚(Mylopharyngodon piceus)肌漿蛋白IgG/IgE結(jié)合能力的變化

朱一丹，謝國錦，高嶺，楊方*，高沛，余達(dá)威，姜啟興，許艷順，夏文水*

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室、食品學(xué)院、江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫，214122) 2(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京，210000)

食物過敏可能引起哮喘、蕁麻疹、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時甚至?xí)p壞機體組織并威脅生命安全。作為八大過敏原之一，魚類引起的過敏現(xiàn)象在全球都很普遍[1-4]。目前國內(nèi)外針對魚類過敏的研究主要集中在海水魚方面。但淡水魚是中國飲食的主要魚類蛋白來源，且近年來的消費量日益增多[5]，也存在著高致敏隱患。石徑等[6]研究表明，草魚、鯉魚和鳙魚的肌漿蛋白和過敏患者血清的陽性率分別為16.00%、8.00%和5.33%。

90%的魚類致敏反應(yīng)是由小清蛋白(parvalbumin, PV)導(dǎo)致的。小清蛋白主要存在于肌漿蛋白[7-8]，是一種分子質(zhì)量約為11 k～14 kDa的鈣結(jié)合蛋白。這些鈣結(jié)合蛋白的區(qū)域與結(jié)合魚過敏患者的構(gòu)象表位有關(guān)[9]。而且，不同魚類的小清蛋白存在著較高的交叉反應(yīng)性[2]。除了小清蛋白外，其他肌漿蛋白蛋白條帶也被發(fā)現(xiàn)有致敏作用，包括原肌球蛋白[10]、烯醇化酶、醛縮酶[11]等。劉楚怡等[12]在研究草魚、烏鱧、鲇魚和花鱸時發(fā)現(xiàn)每種魚都存在4～6條蛋白條帶與IgE結(jié)合時呈陽性。張晶宇等[13]發(fā)現(xiàn)耐胃蛋白酶酶解牙鲆魚的大部分蛋白質(zhì)是過敏原。國際上對于降低海水魚蛋白致敏性的研究較多，但在淡水魚方面鮮有報道。本研究是以中國七大家魚之一的青魚(Mylopharyngodonpiceus)為研究對象，采用不同的pH和離子強度對魚致敏蛋白進(jìn)行處理，并比較致敏蛋白的IgG/IgE結(jié)合能力。采用圓二色譜，表面疏水性，內(nèi)源熒光值等方法測定不同條件下致敏蛋白的結(jié)構(gòu)變化，為以后開發(fā)魚類低敏食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮青魚購自無錫歐尚超市(博大店)，敲打頭部致暈后宰殺，去除頭部鱗片及內(nèi)臟，在冰盒內(nèi)于30 min內(nèi)運往實驗室；在室溫條件下將魚類清洗、去皮、取背部白色肌肉備用。

過敏患者血清來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院在過敏原檢測報告中對魚類過敏原檢測為陽性的兒童患者。所有血清樣本在使用前于-55 ℃下保存。

8-苯胺-1-萘磺酸，鼠抗小清蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗人IgE抗體，美國Sigma公司； HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，美國Proteintech公司；30% 丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺復(fù)合液、1 mol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 pH 6.8)、1.5 mol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 pH 8.8)、過硫酸銨、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺、SDS電泳緩沖液(三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸 Tris-Gly)、10%十二烷基磺酸鈉(10% SDS)、2×蛋白上樣緩沖液、彩色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，碧云天公司；其余試劑若無特殊說明均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3 K15冷凍離心，Sigma公司；LE438 pH 計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SMP500-16295-OBVN酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；電泳儀 Bio-RAD；ChemiDoc XRS+ 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；T10 basic ULTRA-TURRAX 均質(zhì)機，艾卡儀器設(shè)備有限公司；F-7000 熒光光度計，日本日立公司；UV-1000 紫外分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司；MOS-450 分光偏振計，法國Biologic公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青魚肌漿蛋白的制備

參考LIU等[14]的方法且略作調(diào)整。5 g攪碎的魚肉中加入4倍冷的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5)。均質(zhì)后在4 ℃靜置30 min。4 ℃下以10 000×g離心20 min，所得上清液即為肌漿蛋白溶液。蛋白濃度使用雙縮脲法檢測。使用不同pH的磷酸鹽緩沖液得到不同pH實驗組。使用不同濃度的NaCl溶液得到離子強度實驗組。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)

參考LIN等[15]的電泳方法對肌漿蛋白組成進(jìn)行分析。樣品與上樣緩沖液以體積比1∶1混合后煮沸4 min。分別取10 μL上樣于電泳膠中(分離膠12%，濃縮膠5%)。在80 V電壓下跑至兩膠分界線。改成120 V跑至離底部5 cm高處后停止?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色液染色2 h后，脫色過夜。

1.3.3 間接酶聯(lián)免疫吸附測定(indirect-enzyme linked immunosorbent assay, 間接 ELISA)

參照MA等[16]的方法且略作調(diào)整。使用包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋樣品至一定濃度后，取100 μL/孔的規(guī)格于96孔板并于4 ℃下包被過夜。將PBST洗滌液(含有0.1% Tween-20的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)以250 μL/孔的規(guī)格進(jìn)行4次清洗。將B-PBST封閉液(含有1%牛血清蛋白的PBST溶液)以100 μL/孔的規(guī)格加入96孔板，37 ℃恒溫封閉1.5 h。4次清洗后，加入100 μL/孔的鼠抗小清蛋白單克隆抗體(1∶2 000)或魚過敏患者血清(1∶5)作為一抗37 ℃恒溫孵育1.5 h。4次清洗后，加入100 μL/孔的 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)或HRP 標(biāo)記的羊抗人IgE(1∶500)作為二抗37 ℃恒溫孵育1.5 h。將顯色液A(含有0.2 mol/L乙酸鈉、0.017 mol/L檸檬酸，0.06% 體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水)和顯色液B(1.1 mmol/L EDTA-1Na、0.01 mol/L檸檬酸、10%甘油)進(jìn)行1∶1混合，以100 μL/孔的規(guī)格加入96孔板中，37 ℃恒溫孵育20 min；以50 μL/孔的規(guī)格加入2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，迅速在酶標(biāo)儀上讀取450 nm和630 nm處的OD值，實際OD值=OD450 nm-OD630 nm。

1.3.4 免疫印跡分析

參考LYU等[17]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。將不同條件下的肌漿蛋白在SDS-PAGE結(jié)束后，用電泳儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。轉(zhuǎn)印條件為200 mA恒流,20 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%的脫脂奶粉37 ℃封1 h。使用TBST[含有0.15 mol/L NaCl、2%(體積分?jǐn)?shù))1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0]洗滌3次，每次10 min。以鼠抗小清蛋白單克隆抗體(1∶5 000)作為一抗4 ℃恒溫孵育過夜。洗滌后以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500)作為二抗室溫孵育1 h。清洗后使用顯色劑顯色并于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.3.5 表面疏水性的測定

將蛋白溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，分別取2 mL稀釋好的蛋白溶液和10 μL 8 mmol/L的8-苯胺-1-萘磺酸溶液在暗處反應(yīng)10 min后，在激發(fā)波長 375 nm，發(fā)射波長485 nm，狹縫寬度均為 10 nm 的條件下，測定OD值。以蛋白濃度作為x軸，OD值作為y軸，曲線斜率即為表面疏水性。

1.3.6 內(nèi)源熒光值的測定

將所有樣品稀釋成1 mg/mL。采用熒光光譜儀測定內(nèi)源熒光值。激發(fā)波長為 290 nm,發(fā)射波長為300～380 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.3.7 紫外二階圖譜的測定

將所有樣品稀釋成1 mg/mL。采用紫外分光光度計在190～300 nm進(jìn)行掃描，讀取OD值并進(jìn)行二階求導(dǎo)。

1.3.8 圓二色譜的測定

將所有樣品稀釋成0.1 mg/mL。采用圓二色譜法(circular dichroism，CD)分析不同條件下肌漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化。掃描波長為190～260 nm。掃描速率為50 nm/min,帶寬為1 nm，響應(yīng)時間為2 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s檢驗法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對青魚肌漿蛋白的影響

2.1.1 不同pH對青魚肌漿蛋白IgG/IgE結(jié)合能力的影響

許多食品加工過程往往都存在著pH的改變，例如在酸魚發(fā)酵過程中，魚制品的pH會從6.5降低到4.5[18]。因此，對于pH和肌漿蛋白致敏能力關(guān)系的機理研究對于開發(fā)低敏魚制品是至關(guān)重要的。采用間接ELISA法檢測不同pH條件下的肌漿蛋白與鼠抗小清蛋白單克隆抗體IgG和魚過敏患者血清特異性IgE結(jié)合能力，結(jié)果如圖1所示。

a-IgG-結(jié)合能力;b- IgE-結(jié)合能力圖1 不同pH處理后的青魚肌漿蛋白與IgG和IgE的結(jié)合能力Fig.1 Analysis of IgG-binding and IgE-binding of protein from black carp exposed to different pH注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

除了主要致敏蛋白小清蛋白外，還存在著其他的致敏蛋白，因而，本文同時分析了肌漿蛋白中的小清蛋白的IgG結(jié)合能力和肌漿蛋白的IgE結(jié)合能力?？傮w來看，pH從4.0到7.0，肌漿蛋白和IgG和IgE的結(jié)合能力略呈變強的趨勢。圖1-a中pH<6.5時IgG結(jié)合能力變化較小，而在pH達(dá)到7.0時呈現(xiàn)較強的結(jié)合能力。圖1-b顯示，在pH為4.0時，IgE的結(jié)合能力最低，其吸光值為1.53。在pH為7.0時，IgE的結(jié)合能力最高，吸光值為1.74。說明在pH 4.0～7.0，肌漿蛋白的IgG/IgE結(jié)合能力隨pH的升高而變強。

圖2為不同PH處理后的青魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析和免疫印跡分析，由圖2-a可知，在pH 4.0～7.0，肌漿蛋白(包括分子質(zhì)量為11 kDa左右的小清蛋白)沒有發(fā)生明顯的聚集或沉降，也沒有新的蛋白條帶產(chǎn)生。LIN等[15]研究發(fā)現(xiàn)短頸蛤的致敏蛋白原肌球蛋白在pH 4.0到7.0，IgG和IgE結(jié)合能力都比較穩(wěn)定，僅有小幅度的增長。ZHANG等[19]的研究顯示，免疫印跡分析中的煮沸步驟可以展開蛋白使其成為直鏈,而間接ELISA分析則仍然保持其空間結(jié)構(gòu)。因此，可以通過比較兩者的結(jié)果來區(qū)分肌漿蛋白的致敏能力是由構(gòu)象表位還是線性表位引起的。不同pH肌漿蛋白的免疫印跡分析如圖2-b顯示，組間的區(qū)別不明顯，由此可以推測肌漿蛋白與IgG/IgE結(jié)合的作用位點可能為構(gòu)象表位而非線性表位。

a-SDS-PAGE；b-免疫印跡分析圖2 不同pH處理后的青魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析和免疫印跡分析Fig.2 The SDS-PAGE patterns and western blotting profiles of sarcoplasmic protein from black carp exposed to different pH注：M代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白(圖5同)

2.1.2 不同pH對青魚肌漿蛋白結(jié)構(gòu)的影響

不同pH下肌漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)改變通過圓二色譜來測定，如圖3-a結(jié)果顯示，pH從4.0增加至7.0時，β-折疊含量變化不顯著，而β-螺旋含量逐漸上升，從56.80%增加到67.40%，不規(guī)則卷曲含量則逐漸降低，從29.80%到13.40%。肌漿蛋白的表面疏水性隨pH的變化如圖3-b所示。隨著pH的升高，肌漿蛋白表面疏水性顯著降低。與pH 4.0相比，pH 4.5到7.0的表面疏水性分別降低了57.65%、74.15%、81.43%、84.93%、91.03%、91.60%。說明在pH升高時，主要發(fā)生了蛋白疏水相互作用，造成表面疏水性的下降。肌漿蛋白中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸是產(chǎn)生熒光信號的主要基團，且色氨酸因為其靈敏性較高和受干擾較小的特點而常常用于檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。為得到較強的熒光信號且避免其他氨基酸的干擾，本實驗中選用290 nm的激發(fā)波長[20]。最大發(fā)射波長向長波移動意味著氨基酸殘基從天然的疏水腔內(nèi)向暴露在純水環(huán)境下轉(zhuǎn)變[21-23]。熒光強度的降低表明芳香族殘基從蛋白質(zhì)的疏水腔中逐漸向極性環(huán)境暴露[24]。且小清蛋白中色氨酸含量極小，因而可以用來研究除主要致敏蛋白小清蛋白外的其他蛋白的結(jié)構(gòu)變化。由表1也可以看出，pH降低使最大發(fā)射波長向長波移動，且內(nèi)源熒光強度值相應(yīng)的降低，說明色氨酸殘基暴露于極性環(huán)境中。這與表面疏水性的升高的結(jié)果是一致的。

a-二級結(jié)構(gòu)；b-表面疏水性圖3 不同pH對青魚肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性的影響Fig.3 The effect of different pH on the secondary structure and surface hydrophobicity of sarcoplasmic protein from black carp

表1 不同pH對青魚肌漿蛋白內(nèi)源熒光強度的影響Table 1 The effect of different pH on intrinsic fluorescence intensity of sarcoplasmic protein from black carp

2.2 不同離子強度對青魚肌漿蛋白的影響

2.2.1 不同離子強度對青魚肌漿蛋白IgG/IgE結(jié)合能力的影響

采用間接ELISA法檢測不同離子強度條件下的肌漿蛋白與鼠抗小清蛋白單克隆抗體IgG和魚過敏患者血清特異性IgE結(jié)合能力的結(jié)果如圖4所示。無論是肌漿蛋白與IgG還是IgE的結(jié)合，都沒有顯著性的差異。說明肌漿蛋白和小清蛋白的構(gòu)象表位結(jié)合能力并不會隨離子強度的改變而改變。同樣地，由圖5-a顯示，肌漿蛋白的組成和含量也沒有改變。由圖5-b的免疫印跡顯示，離子強度為0.2～1.0時，蛋白條帶無明顯變化，離子強度為0時則顯示出稍強的結(jié)合能力，說明該條件下的線性表位結(jié)合能力略強。

a-IgG結(jié)合能力；b-IgE結(jié)合能力圖4 不同離子強度處理后的青魚肌漿蛋白與IgG和IgE的結(jié)合能力Fig.4 Analysis of IgG-binding and IgE-binding of sarcoplasmic protein from black carp exposed to different ion strength

a-SDS-PAGE;b-免疫印跡分析圖5 不同離子強度處理后的青魚肌漿蛋白的SDS-PAGE分析和免疫印跡分析Fig.5 The SDS-PAGE patterns and western blotting profiles of sarcoplasmic protein from black carp exposed to different ion strength

2.2.2 不同離子強度對青魚肌漿蛋白結(jié)構(gòu)的影響

不同離子強度下肌漿蛋白的二級結(jié)構(gòu)的改變通過圓二色譜來測定，如圖6-a結(jié)果顯示，當(dāng)離子強度為0時，肌漿蛋白的α-螺旋含量顯著高于其他組，為40.20%。相應(yīng)的不規(guī)則卷曲含量最小，為15.50%。肌漿蛋白的表面疏水性隨離子強度的變化如圖6-b所示。離子強度為0時的表面疏水性比離子強度為0.2 時的表面疏水性降低了67.88%。但在離子強度0.4到1.0時則無顯著性差異。說明離子的存在暴露了更多的疏水基團。如表2所示，肌漿蛋白的內(nèi)源熒光強度值在離子強度為0時較小，色氨酸疏水基暴露，這與表面疏水性的結(jié)果并不完全一致，推測可能是由于除色氨酸以外的其他基團的結(jié)構(gòu)變化影響了表面疏水性，這需后續(xù)實驗進(jìn)一步驗證。

a-二級結(jié)構(gòu);b-表面疏水性圖6 不同離子強度處理對青魚肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)和表面疏水性的影響Fig.6 The effect of different ion strength on the secondary structure and surface hydrophobicity of sarcoplasmic protein from black carp

表2 不同離子強度對青魚肌漿蛋白內(nèi)源熒光強度的影響Table 2 The effect of different pH on intrinsic fluorescence intensity of sarcoplasmic protein from black carp

3 結(jié)論

不同的pH條件下的青魚肌漿蛋白的IgG/IgE結(jié)合能力不同，在pH 4.0～7.0時，pH越高，肌漿蛋白的IgG/IgE結(jié)合能力越強，高pH條件下的肌漿蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量較高，不規(guī)則卷曲含量減少。表面疏水性降低，更多的色氨酸疏水基留在疏水腔內(nèi)。蛋白結(jié)構(gòu)變化趨勢與蛋白IgG/IgE結(jié)合能力變化趨勢相似，說明蛋白IgG/IgE結(jié)合能力與構(gòu)象表位有關(guān)。離子強度在0～1.0時對IgG/IgE結(jié)合能力沒有顯著影響。離子強度為0時α-螺旋含量較高，表面疏水性顯著減小，色氨酸殘基暴露于極性環(huán)境，而離子強度大于0.2的組間則無顯著差異。推測肌漿蛋白IgG/IgE結(jié)合能力的變化主要是由致敏蛋白二級結(jié)構(gòu)的改變引起的，但仍需進(jìn)一步驗證。