丁烯酸內(nèi)酯二萜衍生物的制備及抗腫瘤活性研究

左笑菲，楊 帆，張曉梅，陳凌云，趙 慶

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500

二萜成分在姜科姜花屬植物中廣泛存在，其中部分二萜具有顯著的細(xì)胞毒、抗腫瘤等生物活性[1-3]。本課題組對(duì)該屬植物二萜進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從滇姜花、圓瓣姜花和毛姜花[4-7]中分離得到一些對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著體外細(xì)胞毒活性的二萜成分。對(duì)滇姜花的粗提物、二萜成分滇姜花素A和hedychenone進(jìn)行了小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試，結(jié)果表明它們均能顯著性抑制小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22的生長，其中滇姜花素A對(duì)H22腫瘤生長抑制率較高，為54.27%[4]。進(jìn)一步的研究表明，化合物滇姜花素C、7-hydroxy-hedychenone對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22的生長也具有顯著的抑制作用[8]。前期工作還表明，具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的二萜成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞大多具有較高的體外細(xì)胞毒活性。例如呋喃二萜coronarin E沒有細(xì)胞毒活性；但如果將coronarin E氧化，得到的一個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的二萜(4，圖1)對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株具有不同程度的細(xì)胞毒活性[6]。據(jù)此初步推測(cè)：具有呋喃型二萜成分呋喃環(huán)轉(zhuǎn)化為具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物，有可能提高其細(xì)胞毒活性。雖然呋喃二萜轉(zhuǎn)化為丁烯酸內(nèi)酯型二萜通?？梢蕴岣咂潴w外細(xì)胞毒活性，但其體內(nèi)抗腫瘤活性是否也同時(shí)提高，需要進(jìn)一步探討。因此，我們的后續(xù)工作以二萜coronarin E、hedychenone和滇姜花素A[9]為原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備了三個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物，并對(duì)這三個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行了對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180的抗腫瘤活性測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料

核磁共振氫譜、碳譜由BrukerAM-400超導(dǎo)型核磁共振儀測(cè)定。柱色譜硅膠(300～400目)和硅膠H(青島海洋化工廠)。薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠)，薄層顯色的常規(guī)方法為：5%硫酸-乙醇溶液在150 ℃下烘烤顯色明顯。

二萜成分coronarin E(1)、hedychenone(2)、滇姜花素A(3)均由云南中醫(yī)藥大學(xué)趙慶課題組提供。

H22細(xì)胞株(江陰齊式生物科技有限公司)。S180細(xì)胞株(昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫)。清潔級(jí)ICR小鼠共100只，雌雄各半，體重18～21 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(編號(hào)SCXK(滇)K2015-0002)。白血病細(xì)胞株HL-60、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、肺癌細(xì)胞株A-549、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480均由中國科學(xué)院昆明植物研究所分析測(cè)試中心提供。

1.2 三個(gè)二萜成分的結(jié)構(gòu)改造

1.2.1 Coronarin E(1)的光敏氧化反應(yīng)制備化合物4

Coronarin E(1)光敏氧化制備化合物4參見文獻(xiàn)[10]：取1.00 g coronarin E(1)，溶于250 mL干燥的二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，加入20 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌，在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)6 h，TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。蒸干溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，得到化合物4[10](0.81 g，白色粉末，產(chǎn)率73%)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1的光敏氧化

1.2.2 Hedychenone(2)的光敏氧化反應(yīng)制備化合物5

取hedychenone(2)1.00 g，溶于250 mL干燥的二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，加入20 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌，在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)6 h，TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。蒸干溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯2∶1洗脫，得到化合物5(0.74 g，白色粉末，產(chǎn)率為67%)?；衔?的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與姜科植物草果藥(Hedychiumspicatum)中發(fā)現(xiàn)的二萜成分spicatanol[11]一致，由此確定化合物5為spicatanol。

圖2 化合物2的光敏氧化

1.2.3 滇姜花素A(3)的?；c光敏氧化反應(yīng)制備化合物7

稱取滇姜花素A(3)2.30 g，溶解于15 g吡啶，緩慢加入苯甲酰氯10 g，在100 ℃下加熱3 h，在常溫下再靜置兩天。將反應(yīng)液傾入200 mL 5%碳酸鈉溶液中，攪拌2 h。用乙酸乙酯萃取兩次(200 mL×2)，萃取液合并后，用10 %磷酸二氫鈉水溶液洗滌三次(50 mL×3)。乙酸乙酯層用無水Na2SO4干燥24 h，濃縮回收。用硅膠柱色譜分離，石油醚：乙酸乙酯(60∶1→10∶1)洗脫。得化合物6(1.40 g，產(chǎn)率40%)。

稱取化合物61.00 g，溶于250 mL無水二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，10 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌。在-45 ℃及LED燈照射下反應(yīng)7 h，TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全。反應(yīng)液濃縮回收，殘余物用二氯甲烷溶解，經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫，得到化合物7(0.47 g,產(chǎn)率31.5%)。7為白色無定形粉末，無明確熔點(diǎn)。根據(jù)反應(yīng)機(jī)理，7的結(jié)構(gòu)式應(yīng)如圖3所示，該結(jié)構(gòu)與高分辯質(zhì)譜確定的分子式C27H32O5相吻合，也與NMR數(shù)據(jù)相符。7與文獻(xiàn)報(bào)道的二萜滇姜花素C[12]結(jié)構(gòu)相似，差別僅在于：7的C-6位為β-羥基取代，而滇姜花素C的C-6位為β-苯甲酰氧基取代。因此,7的二萜結(jié)構(gòu)單元1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)與滇姜花素C很相似，將二者的NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，即可對(duì)7的二萜結(jié)構(gòu)單元的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸宿。再采用軟件Chemdraw對(duì)7的苯甲酰氧基部分的1H NMR和13C NMR進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果對(duì)照，可對(duì)分子中的甲酰氧基結(jié)構(gòu)單元的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬。

圖3 化合物7的制備

1.3 化合物1、2、5、6和7的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試

采用MTT法[13,14]，測(cè)定化合物1、2、5、6和7對(duì)五個(gè)腫瘤細(xì)胞株的體外細(xì)胞毒活性。陽性對(duì)照采用順鉑。

1.4 小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

清潔級(jí)ICR小鼠共100只，雌雄各半，體重18～21 g。每次實(shí)驗(yàn)采用50只小鼠，將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、化合物4組、化合物5組和化合物7組，每組10只小鼠，雌雄各半。小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，于左前肢皮下接種新鮮的H22(或者S180)腫瘤細(xì)胞懸液(0.1 mL/鼠，1×106細(xì)胞)。在接種腫瘤細(xì)胞后的第2日開始按分組給藥。陰性對(duì)照組腹腔注射給予DMSO，陽性對(duì)照組給予異環(huán)磷酰胺，其它各組給予相應(yīng)的待測(cè)物。每天給藥1次，于給藥的第7天將動(dòng)物脫臼處死，完整剝離腫瘤并在電子稱稱腫瘤重量及腫瘤剝離后的動(dòng)物體重。比較分析各組腫瘤重量及瘤重抑制率。

瘤重抑制率=(陰性對(duì)照組腫瘤平均重量(g)-樣品組腫瘤平均重量(g))/陰性對(duì)照組平均腫瘤重量(g)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 新化合物的波譜數(shù)據(jù)

化合物7HR-ESI-MS：m/z475.188 4[M+K]+(calcd for C27H32O5K+，475.188 7)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-18)，1.25(3H，s，H-19)，1.38(3H，s，H-20)，4.60/4.69(1H，H-17a)，5.77(1H，s，H-17b)，4.62(1H，s，H-6)，5.88(1H，s，H-16)，6.29/6.68(1H，s，H-14)，6.36(1H，d，J= 15.9 Hz，H-12)，6.68～6.74(1H，m，H-11)，7.43～7.47(2H，m，H-4′)，7.55～7.58(1H，m，H-5′)，8.02～8.05(2H，m，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：42.2(t，C-1)，19.1(t，C-2)，43.3/43.4(t，C-3)，34.4(s，C-4)，55.8(d，C-5)，71.1(d，C-6)，44.0(t，C-7)，144.2(s，C-8)，62.3(d，C-9)，40.5/40.4(s，C-10)，142.9(d，C-11)，115.9(d，C-12)，144.0(s，C-13)，142.8(d，C-14)，171.2(s，C-15)，97.6/97.7(d，C-16)，111.7/112.1(t，C-17)，33.4(q，C-18)，23.6(q，C-19)，18.1/18.2(q，C-20)，166.2(s，C-1′)，130.5(s，C-2′)，129.6(d，C-3′)，128.5(d，C-4′)，133.0(d，C-5′)。

2.2 化合物1、2、5、6和7對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性

采用MTT法[13,14]測(cè)定化合物1、2、5、6和7對(duì)五種人腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，測(cè)試結(jié)果見表1?；衔?和7對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株均具有顯著的細(xì)胞毒活性，這兩個(gè)化合物對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、肺癌細(xì)胞株A-549、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的抑制活性均超過陽性對(duì)照順鉑。此外，我們的前期研究工作已表明，化合物4對(duì)五種腫瘤細(xì)胞株亦具有不同程度的細(xì)胞毒活性[6]。

表1 化合物1、2、5、6和7對(duì)五種人腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度IC50

2.3 化合物4、5及7對(duì)小鼠體內(nèi)H22腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性

體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖4。小鼠的體重，瘤重均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖4 化合物4、5、7和異環(huán)磷酰胺對(duì)H22荷瘤鼠腫瘤的影響

表2 小鼠體內(nèi)抗H22腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

2.4 化合物4、5及7對(duì)小鼠體內(nèi)S180腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性

體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見表3和圖5。小鼠的體重，瘤重均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖5 化合物4、5、7和異環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤鼠腫瘤的影響

表3 小鼠體內(nèi)抗S180腫瘤實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180抑制活性研究結(jié)果表明，化合物4、5及7均顯示了明顯的體內(nèi)抑瘤活性，其中4對(duì)H22體內(nèi)抑瘤活性較強(qiáng)，抑制率接近陽性對(duì)照藥物異環(huán)磷酰胺?；衔?、7對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180的體內(nèi)抑瘤活性較強(qiáng)，抑制率均超過陽性對(duì)照藥物異環(huán)磷酰胺。

3 討論

采用三個(gè)姜科二萜成分1、2和3經(jīng)結(jié)構(gòu)改造，得到的三個(gè)具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物4、5和7，它們不僅對(duì)五種人類腫瘤細(xì)胞株有很好的體外細(xì)胞毒活性，而且對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180的生長均具有顯著的抑制作用。呋喃型二萜1和2均未顯示細(xì)胞毒活性，而它們?cè)谘趸蟮玫降摩?羥基丁烯酸內(nèi)酯型二萜4[6]和5均具有顯著的細(xì)胞毒活性。在前期工作中，二萜coronarin E(1)對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22未顯示抗腫瘤活性[8]；但是其氧化后得到的化合物4，對(duì)小鼠體內(nèi)移植性腫瘤H22和S180生長的抑制作用較強(qiáng)?；衔?和7的抗腫瘤活性也較強(qiáng)。這說明，將姜科的二萜類成分改造為具有γ-羥基丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的衍生物，有可能提高其抗腫瘤活性。從具有丁烯酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的二萜成分中尋找有苗頭的抗腫瘤活性成分或先導(dǎo)化合物，可作為未來抗腫瘤藥物的一個(gè)研究方向。