黑臭河道修復(fù)菌

何煦妍

◎研究背景

我出生在河網(wǎng)密集的珠江三角洲，從小就在縱橫交錯(cuò)的河道邊長(zhǎng)大。但在我十幾年的記憶中，這些河道大部分都流淌著像墨水一樣的河水，還散發(fā)著陣陣難聞的氣味。為了給河流治病，我上網(wǎng)查閱了大量文獻(xiàn)資料，了解到電纜細(xì)菌極有可能是加速河道黑臭治理的重要微生物！經(jīng)過(guò)請(qǐng)教老師和專(zhuān)家后，我推測(cè)：受?chē)?yán)重污染的黑臭河道沉積物中也存在電纜細(xì)菌，但由于長(zhǎng)期的污染脅迫，這些電纜細(xì)菌具有相對(duì)獨(dú)特的系統(tǒng)分類(lèi)地位;通過(guò)調(diào)節(jié)上覆水體的電子受體將能有效提高黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的豐度，強(qiáng)化產(chǎn)電硫氧化活性，促進(jìn)硫化物氧化，從而加速黑臭河道沉積物修復(fù)。因此，我們選取了珠江三角洲河道污染相當(dāng)嚴(yán)重的順德容桂的河道作為主要研究對(duì)象，開(kāi)展黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的培養(yǎng)和功能活性研究，希望通過(guò)這項(xiàng)研究創(chuàng)新黑臭河道治理技術(shù)，加速河道生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)進(jìn)程。

◎研究方法及過(guò)程

沉積物樣品的采集和處理

實(shí)驗(yàn)所用的沉積物采自順德容桂某典型電器工業(yè)聚集區(qū)的黑臭河道。將采集回來(lái)的河道沉積物過(guò)篩（0.35mm，45目），去掉樹(shù)枝樹(shù)葉類(lèi)的雜質(zhì)及大的顆粒物。其中一部分新鮮沉積物裝入100mL燒杯中用于電纜細(xì)菌的富集培養(yǎng)，另一部分經(jīng)冷凍千燥、研磨過(guò)篩（0.15mm，100目），-20C保存用于進(jìn)一步分析沉積物中污染物的組成特征。將裝有新鮮沉積物的100mL燒杯置于充滿(mǎn)河水、水溫維持在25土1C的池子中，使上覆水高10cm。分別采用曝氣充氧和投加硝酸鹽2種方式調(diào)節(jié)上覆水體中電子受體的濃度，在培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、15、18、24、30和50天時(shí)測(cè)定沉積物的環(huán)境參數(shù)，并采集表層2cm的沉積物貯存于一80C，用于分析微生物菌群結(jié)構(gòu)、酸揮發(fā)性硫化物（AVS）、硫酸根和總有機(jī)碳（TOC）的含量。

理化參數(shù)檢測(cè)方法

沉積物的常規(guī)指標(biāo)主要參考《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》進(jìn)行測(cè)定。另外，還測(cè)定了沉積物中AVS含量。

微電極分析

采用微電極系統(tǒng)分析沉積物中O₂、pH值和H₂S隨深度的變化特點(diǎn)。采用100%氧飽和水和溶解氧濃度為0的水作為2個(gè)校對(duì)點(diǎn)用于校對(duì)氧電極;pH值為4.00、6.86和9.18的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液用于校對(duì)pH電極;H₂S電極則在暗室中采用無(wú)氧的HCI（32S=[H₂S]+[HS^-]+[S^2-]。

電纜細(xì)菌的掃描電鏡（SEM）和熒光原位雜交（FISH）鑒定

選取培養(yǎng)了15天且具有明顯產(chǎn)電硫氧化特征曲線(xiàn)的沉積物樣品，挑取這些樣品表層2cm的培養(yǎng)物，在盛有無(wú)菌水的白瓷盤(pán)中輕輕淘洗長(zhǎng)度達(dá)lcm以上的長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物，一部分置于細(xì)胞爬片上固定、脫水、風(fēng)千用于SEM觀(guān)察細(xì)胞形態(tài);另一部分采用終濃度為50%（vol/vol）乙醇固定、-20C低溫保藏用于FISH。分別采用Desulfobulbaceae的特異性熒光探針DSB706和核酸的常規(guī)熒光染料DAPI（4，6，-diamidino-2-phenylindole）對(duì)所獲取的長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物進(jìn)行FISH，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss）觀(guān)察雜交結(jié)果。

電纜細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建與分析

構(gòu)建16SrRNA基因全長(zhǎng)克隆庫(kù)，挑取陽(yáng)性克隆子送樣到上海生工進(jìn)行測(cè)序。把得到的16SrRNA基因通過(guò)BLAST，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA序列比對(duì)，記錄同源性最高的細(xì)菌類(lèi)型，并下載該細(xì)菌的16SrRNA基因。把下載的序列和拼接得到的樣品序列用ClustalW軟件進(jìn)行比對(duì)，再將比對(duì)結(jié)果用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在iTOL（http：//itol.embl.de/）中展示所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

研究結(jié)果與討論

黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的培養(yǎng)

采集曝氣充氧和投加硝酸鹽2種培養(yǎng)體系富集培養(yǎng)了15天的表層2cm沉積物樣品進(jìn)行淘洗，均分離到大量長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物。分別采用紅色的Desulfobulbaceae特異性熒光探針DSB706和藍(lán)色熒光探針DAPI對(duì)長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物進(jìn)行FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些長(zhǎng)線(xiàn)狀細(xì)胞都可以被這2種探針同時(shí)雜交，經(jīng)紅藍(lán)2種熒光疊加后，目標(biāo)菌株在熒光顯微鏡下呈粉紅顏色。采用SEM進(jìn)一步觀(guān)察這些長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所富集到的長(zhǎng)線(xiàn)狀微生物細(xì)胞直徑約為0.8um，且沿著細(xì)胞長(zhǎng)度可以觀(guān)察到明顯的脊?fàn)钔黄?，這與國(guó)際上已報(bào)道的電纜細(xì)菌形狀特征相當(dāng)一致。

進(jìn)一步在倒置顯微鏡下比較曝氣充氧和投加硝酸鹽2種培養(yǎng)體系中長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物的豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)曝氣充氧組中培養(yǎng)物的平均豐度約為投加硝酸鹽組的3倍?？梢?jiàn)，曝氣充氧這種培養(yǎng)方式更有利于電纜細(xì)菌的富集生長(zhǎng)。

黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的鑒定

為了了解黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的種類(lèi)及其系統(tǒng)分類(lèi)地位，我們提取了淘洗獲得的長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物總DNA，分析這些長(zhǎng)線(xiàn)狀培養(yǎng)物的16SrRNA基因序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管這些培養(yǎng)物大約有14.58%仍然未能在科的水平被鑒定，但超過(guò)61.16%歸屬于Desulfobulbaceae科。進(jìn)一步構(gòu)建了這些培養(yǎng)物的全長(zhǎng)16SrRNA基因克隆庫(kù)，在GenBank中對(duì)這些基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得39個(gè)歸屬于Desulfobulbaceae的克隆子。通過(guò)分析比較這些序列與已報(bào)道電纜細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這39個(gè)序列中除了編號(hào)為RG57的序列外，其他幾乎都聚在同一個(gè)分支，而且與國(guó)際上已報(bào)道的分離自河流沉積物的電纜細(xì)菌F3（KP728463）的相似性介于93.04%～97.57%。編號(hào)為RG57的序列與國(guó)際已報(bào)道的分離自河流沉積物的電纜細(xì)菌F5（KP728465）的相似性最高，但僅為87.72%。由此可見(jiàn)，珠三角黑臭河道沉積物中的確存在電纜細(xì)菌，但與國(guó)際上已報(bào)道的電纜細(xì)菌相比，它們具有相對(duì)獨(dú)立的系統(tǒng)分類(lèi)地位。

黑臭河道沉積物中電纜細(xì)菌的產(chǎn)電硫氧化活性特點(diǎn)

結(jié)合倒置顯微鏡觀(guān)察和微電極系統(tǒng)分析，跟蹤監(jiān)測(cè)曝氣充氧培養(yǎng)電纜細(xì)菌過(guò)程中黑臭沉積物O2、pH值和H，S等指標(biāo)隨深度的變化特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的前6天，體系中電纜細(xì)菌的豐度極低，每立方厘米的沉積物中僅能觀(guān)察到3～5根電纜細(xì)菌，這時(shí)候微電極系統(tǒng)并不能檢測(cè)到產(chǎn)電硫氧化曲線(xiàn)，沉積物中以基于擴(kuò)散的氧化還原反應(yīng)為主。培養(yǎng)至6～9天時(shí)，沉積物中電纜細(xì)菌的豐度提高了近千倍，這時(shí)微電極系統(tǒng)也檢測(cè)到了典型的產(chǎn)電硫氧化曲線(xiàn)，電纜細(xì)菌以沉積物中的硫化物為電子供本、以上覆水體中的溶解氧為電子受體進(jìn)行長(zhǎng)距離電子傳遞。培養(yǎng)至第12～15天時(shí)，電纜細(xì)菌的豐度達(dá)到最高，此時(shí)體系種的pH值也達(dá)到最高（8.7），意味著這個(gè)時(shí)候電纜細(xì)菌所驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)電硫氧化過(guò)程氧化還原半反應(yīng)最活躍。培養(yǎng)18天后，電纜細(xì)菌的豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，產(chǎn)電硫氧化過(guò)程的氧化還原半版應(yīng)也相應(yīng)減弱，但是氧化半反應(yīng)和還原半反應(yīng)相隔越來(lái)越遠(yuǎn)。培養(yǎng)到第30天時(shí)，電纜細(xì)菌的豐度恢復(fù)到培養(yǎng)早期的水平，產(chǎn)電硫氧化過(guò)程的氧化還原半反應(yīng)明顯下降。而沒(méi)有進(jìn)行曝氣充氧的對(duì)照組并沒(méi)有觀(guān)察到明顯的變化。

進(jìn)一步分析沉積物中硫元素的組成變化特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)4周的培養(yǎng)，曝氣充氧處理組的沉積物中AVS的去除速率明顯比對(duì)照組高，其含量由最初的（917.0土60.2）ug/g降低為（342.8土53.3）ug/g，而對(duì)照組中AVS的含量則仍高達(dá)（757.7土34.2）ug/g。與此同時(shí)，處理組孔隙水中硫酸根的含量也由最初的152.1mmol/L升高至1844.5mmol/L，明顯高于對(duì)照組的394.4mmol/L。

這些研究結(jié)果充分表明，珠三角黑臭河道沉積物中的電纜細(xì)菌同樣具有產(chǎn)電硫氧化活性。曝氣充氧可以有效促進(jìn)電纜細(xì)菌的生長(zhǎng)，提高其產(chǎn)電硫氧化功能活性，使沉積物中的硫化物快速氧化為硫酸鹽，從而緩解黑臭。

◎主要研究結(jié)論

◆本研究成功建立了從黑臭河道

沉積物中富集培養(yǎng)電纜細(xì)菌的方法，并獲得了獨(dú)特的、具有產(chǎn)電硫氧化功能的電纜細(xì)菌。

◆電纜細(xì)菌能將黑臭河道沉積物中的硫化物快速氧化為硫酸鹽，有效緩解黑臭現(xiàn)象。

該項(xiàng)目獲得第34屆全國(guó)青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競(jìng)賽項(xiàng)目中學(xué)組環(huán)境科學(xué)與工程一等獎(jiǎng)。

專(zhuān)家評(píng)語(yǔ)

本研究首次從黑臭河道底泥沉積物中培養(yǎng)出電纜細(xì)菌，探明了該細(xì)菌的獨(dú)特分類(lèi)地位及產(chǎn)電硫氧化特性，闡明了電纜細(xì)菌快速氧化硫化物緩解河道黑臭的機(jī)理。建議在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展電纜細(xì)菌對(duì)黑臭河道的水質(zhì)凈化效能研究。

指導(dǎo)教師 許家裕 汪欣