EMS 誘變技術(shù)研究概況及應(yīng)用進(jìn)展

謝玲玲，周火強(qiáng)，弭寶彬，倪向江，陳玲歡

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410125；2. 長沙市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，湖南 長沙 410003）

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）是 一種烷化劑，其誘變機(jī)理是通過與核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反應(yīng)來誘發(fā)突變。EMS 誘發(fā)形成突變體主要通過兩個(gè)步驟完成：首先鳥嘌呤的C6 位置被烷基化，而后在DNA 復(fù)制過程中，烷基化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對，導(dǎo)致堿基交換，即G：C 變?yōu)锳：T，形成點(diǎn)突變[1]。采用EMS 作為誘變劑，具有易操作、成本低、專一性強(qiáng)，產(chǎn)生點(diǎn)突變頻率高，出現(xiàn)染色體畸變頻率低等優(yōu)勢[2]。EMS 作為一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，是當(dāng)前構(gòu)建大規(guī)模飽和突變體庫的理想誘變方法[3-5]，目前在誘變育種中應(yīng)用最為廣泛，效果也最好。

早在20 世紀(jì)60 年代，人們就已開始采用EMS 水溶液處理植物種子，但誘變效率很低。自Neuffer等將EMS 溶于石蠟油中處理玉米花粉獲得成功后，石蠟油-EMS 處理花粉誘變技術(shù)在國外廣泛應(yīng)用起 來[6]。我國于80 年代末期開始進(jìn)行EMS 誘變研究。杜連恩等研究發(fā)現(xiàn)，平陽霉素（PYM）后處理能提高甲基磺酸乙醋（EMS）的誘變效果。試驗(yàn)結(jié)果證明，EMS 處理小麥濕種子附加PYM 后處理的MZ 代植株誘變頻率為8.9%～19.2 %，較EMS（5.7%）單獨(dú)處理的效果提高了1.5～3.0 倍。此為我國有文獻(xiàn)報(bào)道的最早的EMS 誘變相關(guān)的研究，進(jìn)入21 世紀(jì)后，我國EMS 誘變研究迅速發(fā)展。

1 EMS 誘變材料

EMS 誘變可選取的材料十分廣泛，除模式作物擬南芥外，幾乎涵蓋了整個(gè)植物界，其中糧食類作物如水稻、玉米、小麥、高粱、蕎麥、馬鈴薯等；經(jīng)濟(jì)作物如油菜、大豆、棉花、煙草、木薯、亞麻薺、花生、芝麻、甘蔗、花椒等；蔬菜類如大白菜、冬瓜、黃瓜、苦瓜、茄子、芥菜、番茄、卷心菜、豇豆、山藥、紫蘇等；水果類如西瓜、獼猴桃、甜橙、草莓、菠蘿、越橘等；花卉類如蘭花、長春花，藍(lán)花丹等；樹木類如楊樹等；草類如狗牙根、黃花苜蓿、蒺藜苜蓿、扁蓿豆、紅豆草、多枝賴草、高羊茅等，藥用植物如黨參等；菌類如枯草芽孢桿菌、酵母等；藻類如三角褐指藻、小球藻等；甚至于原生質(zhì)體也已成為EMS 誘變的材料。

2 誘變方法

采用EMS 誘變的方法較多，包括種子誘變、花粉誘變、離體誘變等[7]，誘變的部位也因植物種類而異。研究者通常根據(jù)作物的繁殖方式和染色體倍數(shù)來選擇誘變的部位，比如種子、花藥、花粉、塊莖和葉片等。一般作物的化學(xué)誘變最常用的供試材料是種子和花粉，也可采用愈傷組織。誘變材料的處理途徑根據(jù)供試材料的不同有所差別，常用的途徑有浸泡法（種子、芽）、滴液法（莖）、注射法（花器）、涂抹法（花絲、莖）和共培養(yǎng)法（根、花藥）等[8]。

不同的物種對EMS 的敏感程度不同，對 EMS 的濃度、處理溫度和處理時(shí)間的反應(yīng)效應(yīng)也不同，必須通過預(yù)備試驗(yàn)來確定EMS 誘變的最佳劑量[9]。另外，同一物種不同的組織或器官對EMS 的敏感程度也不一樣，因此，無論采用哪種誘變方法，以什么物種、組織或器官作為供試材料，都需要先設(shè)置一系列梯度的濃度和時(shí)間進(jìn)行處理，然后從中選用最適宜的誘變劑量（誘變劑量=誘變液濃度×處理時(shí)間），最佳誘變劑量取決于EMS 誘變濃度和處理時(shí)間的組合[8]。一般情況下，EMS 濃度越低，處理時(shí)間越短，對供試材料產(chǎn)生的生物學(xué)損傷越小，誘變率也越低，隨著 EMS 溶液濃度的提高，誘變率相對增加，對供試材料產(chǎn)生的生物學(xué)損傷也隨之變大，若致死率過高，則誘變失去意義。因而在確定最佳誘變劑量時(shí)，既要保證對種子不會(huì)損傷過大，又能獲得較豐富的變異。目前，普遍采用半致死劑量進(jìn)行大量誘變處理，再通過后代篩選獲得突變體。

2.1 種子誘變

種子作為植物繁衍后代最主要的器官，成為EMS 誘變處理最主要的材料。用EMS 處理植物種子操作簡單，受外界環(huán)境因素影響小，且容易獲得較大的突變體群體[9]。目前采用種子進(jìn)行誘變的報(bào)道較多，材料涉及面廣，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、水果花卉等。譚義川等[10]采用20% PEG-6000 室內(nèi)模擬干旱環(huán)境對EMS 化學(xué)誘變獲得的19 份玉米M4 代誘變系進(jìn)行干旱脅迫，篩選出4 個(gè)抗旱性較好的誘變系。張貞彩等[11]通過對1.2%EMS 處理的濟(jì)麥20、濟(jì)麥22 誘變?nèi)后wM3 單株種子理化特性的分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)小麥品種誘變材料糊化粘度變異程度、變化趨勢均不同，可形成不同品質(zhì)、不同功能的淀粉材料，為小麥淀粉品質(zhì)改良提供了理論和材料基礎(chǔ)。杜園園等[12]采用EMS 處理大豆品種長豆18 和黑豆品種長豆006種子，結(jié)果表明長豆18 的適宜誘變條件以浸種4 h，EMS 處理濃度0.5%，誘導(dǎo)時(shí)間8 h 和浸種4 h，處理濃度0.5%，EMS 誘導(dǎo)時(shí)間12 h 處理最優(yōu)；黑豆品種長豆006 的適宜誘變條件為浸種4 h，處理濃度0.5%，EMS 誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。

2.2 花粉誘變

花粉誘變是獲取突變體的另一有效途徑。利用EMS 進(jìn)行花粉誘變最早始于國外，1986 年，美國ICI種子公司Greaves 等用含有EMS 的石蠟油處理玉米自交系成熟花粉，獲得抗除草劑突變體。1991 年張銘堂利用EMS 處理玉米花粉，發(fā)現(xiàn)糯質(zhì)基因WX 的誘變頻率為 0.12%，后來蒙坦拿大學(xué)從Victor Roboy EMS花粉誘變后代中選出2 個(gè)高油突變體[13]。此后，國內(nèi)一些育種單位逐漸意識(shí)到EMS 花粉誘變技術(shù)的重要性，并相繼開展了相關(guān)研究。陳紹紅等從1998 年開始，以農(nóng)大108 玉米為材料，將其花粉用石蠟油進(jìn)行懸浮處理，經(jīng)M1 代測定，于2001 年獲得高油突變體15 個(gè)。劉治先[14]用EMS 花粉誘變技術(shù)篩選出兩類高油酸玉米突變體，為特用玉米育種和遺傳研究提供了可貴的材料。

2.3 離體誘變

離體誘變處理的對象包括原生質(zhì)體、單細(xì)胞、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、小孢子單核靠邊期的花藥、莖尖或頂端分生組織、處于分生發(fā)育初期的腋芽，以及植物組織或器官的外植體等。國內(nèi)外已有較多對植物進(jìn)行EMS 離體誘變研究的相關(guān)報(bào)道，主要涉及果樹和花卉等領(lǐng)域，所研究植物包括木薯、草莓、海棠、黨參、花生、蘭花、水仙、甜葉菊、唐菖蒲等。石淑穩(wěn)等[15]用0.2%和0.25% EMS 處理小孢子胚狀體3～5 h 均可獲得突變體。和江明等[16]用EMS 溶液和秋水仙素先后處理甘藍(lán)型油菜的小孢子，得到了一份油酸含量達(dá)80%以上的高油酸突變材料。陸榮生等[17]用EMS 處理木薯品種“桂熱-893”組培苗葉片產(chǎn)生的愈傷組織，通過在愈傷增殖、分化及生根培養(yǎng)基中添加一定濃度的草甘膦作為選擇壓力，進(jìn)行抗草甘膦植株離體篩選，共獲得5 個(gè)抗草甘膦無性系，其中2 個(gè)無性系對草甘膦有明顯抗性。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，離體誘變可在短期內(nèi)加強(qiáng)個(gè)別性狀的變異，提高變異頻率和擴(kuò)大變異范圍，并可使誘變、選擇、快繁同時(shí)進(jìn)行，使誘變技術(shù)更為有效[18]。

2.4 理化復(fù)合誘變

理化復(fù)合誘變是指利用 2 種或2 種以上物理、化學(xué)因子依不同處理順序處理植物材料進(jìn)行誘變。其常用的方式為先輻照植物種子，再用含有化學(xué)誘變劑的溶液浸泡。復(fù)合誘變可采用多種物理、化學(xué)組合因子進(jìn)行處理，其中以γ 射線+EMS 復(fù)合處理為最常用的組合方式[19]。由于射線改變了生物膜的完整性和滲透性，從而有助于化學(xué)誘變劑的吸收。已有試驗(yàn)證明，適宜的復(fù)合誘變及其劑量組合具有明顯的累加效應(yīng)或超累加效應(yīng)(協(xié)合效應(yīng) )。劉艷萌等[20]以“全明星”草莓組培苗為試材，分別用甲基磺酸乙酯（EMS）、60Co-γ 射線以及Co-γ 射線+ EMS 的復(fù)合誘變劑對葉片進(jìn)行處理，并對“全明星”草莓進(jìn)行初步耐鹽篩選，結(jié)果表明，復(fù)合誘變處理再生植株的生物產(chǎn)量和耐鹽性顯著高于其他處理。熊大勝[21]等用γ 射線及EMS誘變?nèi)~木通種芽，發(fā)現(xiàn)二者復(fù)合處理能產(chǎn)生早實(shí)變異，童期13 個(gè)月，比對照縮短12 個(gè)月以上，也能產(chǎn)生早熟變異，比對照縮短2 個(gè)月以上。Arumugam 等[22]以γ 射線與 EMS 復(fù)合處理大麥種子，得出大麥類型SMV-2 比K-168 對復(fù)合處理更敏感。鄧占鰲等[23]用γ射線和EMS 誘變柑桔，獲得了“錦橙”和“桃葉橙”的耐鹽突變系。

3 EMS 誘變效應(yīng)分析

EMS 化學(xué)誘變可誘發(fā)任意一個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，即誘變具有非定向，因此其對植物產(chǎn)生的影響幾乎涉及植物的所有組織和器官，從表觀上來看，植物從內(nèi)到外、從上到下的特征特性都有可能發(fā)生改變。

EMS 誘變使植物產(chǎn)生的變化多種多樣。從表1 可以看出，通過EMS 誘變后，植物的莖、葉、花、果實(shí)、種子、卷須、發(fā)育期等都可發(fā)生明顯的變異。相比于其他器官，葉、花、果實(shí)突變頻率較高，且變異類型十分豐富。葉部的突變涉及葉的形狀、顏色、形 態(tài)等，其中葉的黃化突變產(chǎn)生頻率較高，如冬瓜、西瓜、辣椒等都有產(chǎn)生?；ǖ耐蛔兩婕邦伾?、形狀、以及育性，果實(shí)的突變涉及果實(shí)顏色、形狀、形態(tài)等。目前，尚未見有根部突變的相關(guān)報(bào)道，原因可能是根部器官在研究中暫時(shí)未作為重點(diǎn)引起關(guān)注，也可能其本身發(fā)生變異概率小，且根系生長于土壤中不易被觀察。

從EMS 誘變引起的這些突變性狀來看，多數(shù)突變對于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用沒有太大的意義，其中很少一部分能直接作為育種材料使用，但這些突變材料卻能為植物種質(zhì)資源創(chuàng)造、突變體庫建立、功能基因組學(xué)研究等方面發(fā)揮重要作用[24]。

表1 EMS 誘變產(chǎn)生的植物不同部位突變表型分類

4 我國EMS 誘變研究進(jìn)展

論文在很大程度上能直觀反映學(xué)術(shù)研究的進(jìn)展，包括在各類期刊發(fā)表的論文和研究生學(xué)位論文等。同時(shí)，發(fā)明專利也能從一定的側(cè)面反映科學(xué)研究的進(jìn)展程度。筆者對1989 年以來國內(nèi)發(fā)表的EMS 相關(guān)的論文和專利進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，如圖1 所示。早期進(jìn)行EMS研究較少，2000 年之前發(fā)表的相關(guān)論文不超過30 篇，學(xué)位論文研究基本為空白。進(jìn)入到2000 年以后，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，EMS 誘變作為獲取新材料最短平快的方法被廣泛利用，發(fā)表的相關(guān)論文數(shù)量逐年遞增，學(xué)位論文研究也隨之增加。2010 年以后，從事該研究的科研單位與日俱增，論文發(fā)表量顯著上升，其中僅2015 至2019 年期間就有132 篇與之相關(guān)的論文發(fā)表，學(xué)位論文數(shù)量也達(dá)到43 篇，專利數(shù)量在此期間迅猛增加。從圖上數(shù)據(jù)可以看出，我國20 世紀(jì)80 年代末開始進(jìn)行EMS 誘變起步研究，直到20 世紀(jì)末，這期間只有少數(shù)單位從事相關(guān)研究。進(jìn)入21 世紀(jì)后，從事EMS 誘變研究的單位不斷增加，論文發(fā)表數(shù)目呈直線上升趨勢，研究范圍不斷擴(kuò)大，研究內(nèi)容也更加深入。

從文獻(xiàn)研究內(nèi)容來看，早期的EMS 誘變相關(guān)研究主要集中于EMS 誘變條件的改良，誘變對農(nóng)作物性狀產(chǎn)生的影響，以及誘變材料的初步篩選等方面，之后逐漸過渡到突變體庫的構(gòu)建，近期的研究則主要傾向于材料篩選后期群體構(gòu)建、基因定位和遺傳轉(zhuǎn)化等。目前，研究者已利用EMS誘變技術(shù)，成功構(gòu)建水稻、辣椒、大豆、玉米、冬瓜、西瓜、甜瓜、黃瓜等突變體庫。顧佳清[25]等用EMS 對粳稻品種“中花11”種子進(jìn)行誘變處理，產(chǎn)生了穗部、籽粒、莖稈、葉片等形態(tài)突變，篩選并鑒定出突變體材料861 份，初步構(gòu)建了突變體庫。弭寶彬[26]等研究了處理濃度和處理時(shí)間對冬瓜種子萌發(fā)和生長的影響，結(jié)果表明冬瓜種子最佳誘變條件為1.2%EMS 誘變處理12 h，建立了冬瓜種子EMS 誘變體系，構(gòu)建了冬瓜突變體庫。有研究員對玉米花粉進(jìn)行誘變，并構(gòu)建了TILLING 群體，建立了變異豐富的突變體庫。

圖1 我國EMS 誘變相關(guān)論文及專利數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)情況

5 展 望

EMS 誘變因其操作簡便、突變頻率高、染色體畸變頻率低等優(yōu)勢，被現(xiàn)代育種學(xué)研究者廣泛應(yīng)用，EMS 誘變技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了植物功能基因組學(xué)快速發(fā)展，由此誕生了圖位克隆技術(shù)和定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)，后者將傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法和突變體高效篩選有效結(jié)合，具有高通量、低成本的特性，從而大大加快了植物基因組學(xué)的研究進(jìn)程[27]。

與其他育種方法一樣，EMS 誘變同樣存在局限性，如隨機(jī)性太強(qiáng)、自身突變效率不高、有益突變少等，因此難以實(shí)現(xiàn)真正意義上的定向誘變育種。近年來，分子遺傳學(xué)研究不斷深入，利用基因工程技術(shù)輔助育種成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，尤其是 CRISP 技術(shù)，能通過RNA 介導(dǎo)的Cas9 酶切作用，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對基因組進(jìn)行高效定點(diǎn)修飾[28-30]。誘變育種適用于隱性基因控制的個(gè)別性狀改良，若能通過EMS 誘變育種與遺傳工程結(jié)合，具有十分廣闊的前景，譬如離體培養(yǎng)結(jié)合離體誘變和離體篩選。利用基因重組技術(shù)，便有可能直接對DNA 施加誘變處理，獲得離體誘變，實(shí)現(xiàn)“定向誘變”。

EMS 誘變可以實(shí)現(xiàn)在短期內(nèi)獲得大量的突變體，構(gòu)建突變體庫，具有其他誘變育種方式所不具備的優(yōu)點(diǎn)，因此常被現(xiàn)代育種學(xué)家用于大規(guī)模突變研究。目前，學(xué)科間的相互滲透已成為當(dāng)前科學(xué)發(fā)展的一大趨勢，誘變育種學(xué)也必定能揚(yáng)長避短，在與功能基因組學(xué)等相鄰學(xué)科的相互滲透中得到更快的發(fā)展。