糞便SFRP2基因甲基化聯(lián)合定量免疫便潛血檢測在結(jié)直腸癌篩查的應(yīng)用

康 倩, 謝 惠, 王 昕, 張 杰, 李 娜, 盛劍秋

(中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京 100700)

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年增加[1]。有效的篩查可降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率[2]。糞便潛血檢測操作簡便，費(fèi)用低，依從性高，被臨床上廣泛應(yīng)用于早期結(jié)直腸癌的初篩,但存在診斷效能低和假陽性率高的問題[3]。糞便SFRP2基因甲基化是結(jié)直腸癌新的分子標(biāo)志物[4]。本研究將傳統(tǒng)的定量免疫便潛血聯(lián)合糞便SFRP2基因甲基化檢測給結(jié)直腸癌篩查提供新的思路，并取得較好的篩查效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年01月至2018年12月在我中心消化科門診行結(jié)腸鏡檢查和病理檢查確診的106例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，同時(shí)選取106例進(jìn)展性腺瘤患者及106例健康人群，結(jié)直腸癌患者包括男65例，女41例，年齡45～78歲，平均年齡(68.01±6.58)歲；進(jìn)展性腺瘤患者中男62例，女43例，年齡48～77歲，平均年齡(65.16±7.32)歲，健康人群中男63例，女42例，年齡47～80歲，平均年齡66.42±6.48歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①無其它部位腫瘤；②首次確診，無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；③未進(jìn)行化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾接受放化療；②非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況；③肉眼見血性大便者。三組研究對(duì)象年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。三組人群糞便標(biāo)本收集于無菌容器。標(biāo)本于24h內(nèi)保存于-80℃冰箱待測。本研究經(jīng)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1糞便DNA提取，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德國)從糞便標(biāo)本(250 mg)分離DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2亞硫酸氫鹽處理 用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen，德國) 對(duì)基因組DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化和純化。

1.2.3甲基化特異性PCR 重亞硫酸鹽修飾的DNA 作為模板,引物設(shè)計(jì)見表1，反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，非甲基化引物50 ℃退火30 s，甲基化引物62 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。在2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外光凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

表1 SFRP2引物序列

1.2.4定量免疫便潛血法檢測：日本榮研化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)的OC-SENSOR Micro自動(dòng)糞便隱血檢測儀及配套試劑、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品。嚴(yán)格按操作規(guī)程執(zhí)行，儀器自動(dòng)生成打印檢測結(jié)果，以血紅蛋白濃度≥100 ng/mL 為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

結(jié)直腸癌組、進(jìn)展性腺瘤組糞便SFRP2基因甲基化陽性檢出率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌組高于進(jìn)展性腺瘤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。結(jié)直腸癌組、進(jìn)展性腺瘤組定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌組高于進(jìn)展性腺瘤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。結(jié)直腸癌組、進(jìn)展性腺瘤組SFRP2甲基化聯(lián)合定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌組高于進(jìn)展性腺瘤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4。糞便中SFRP2基因甲基化，定量免疫便潛血以及聯(lián)合檢測的靈敏性分別為77.35%，83.96%和93.40%，特異性分別為93.40%，98.11%和93.40%。聯(lián)合檢測在不降低特異性情況下，靈敏性較單獨(dú)檢測顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組糞便SFRP2甲基化檢出率

表3 各組定量免疫便潛血陽性檢出率

表4 SFRP2甲基化聯(lián)合定量免疫便潛血陽性檢出率

3 討 論

結(jié)直腸癌早期沒有明顯特征，大多在中晚期才被確診，故早期篩查結(jié)直腸癌可明顯提高治療效果和延長生存時(shí)間[4]。腸鏡聯(lián)合病理檢查在診斷結(jié)直腸癌中的靈敏性和特異性最高，但國內(nèi)醫(yī)療資源相對(duì)缺乏，同時(shí)患者依從性較差，不適合用于大規(guī)模篩查。糞便潛血實(shí)驗(yàn)作為結(jié)直腸癌篩查重要手段，已在臨床應(yīng)用幾十年。定量免疫便潛血法采用免疫比濁法，通過乳膠凝集光學(xué)檢測技術(shù)自動(dòng)檢測對(duì)糞便中血紅蛋白進(jìn)行定量檢測，檢測精度高，線性范圍寬,靈敏度高，但還存在一定的假陽性[5]。最近研究顯示，表觀遺傳學(xué)在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。由于在糞便中能檢測甲基化，分析糞便的異常甲基化可能為非侵襲性檢測結(jié)直腸癌提供一種新的策略。因此本研究采用聯(lián)合SFRP2基因甲基化作為篩查手段，提高篩查效率。

本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組、進(jìn)展性腺瘤組糞便SFRP2基因甲基化陽性檢出率以及定量免疫便潛血陽性檢出率均高于對(duì)照組(P<0.05)，而且結(jié)直腸癌組高于進(jìn)展性腺瘤組(P<0.05)。SFRP2甲基化聯(lián)合定量免疫便潛血聯(lián)合檢測用于結(jié)直腸癌組、進(jìn)展性腺瘤組檢出率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，結(jié)直腸癌組高于進(jìn)展性腺瘤組(P<0.05)。二者聯(lián)合檢測在不降低特異性情況下，靈敏性高于單獨(dú)檢測(P<0.05)。SFRP2基因甲基化而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默,作為Wnt信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖分化，與結(jié)直腸癌密切相關(guān)[7]。本文結(jié)果說明在健康人群中SFRP2基因發(fā)生甲基化的比例極低，而在結(jié)直腸腫瘤中甲基化比例顯著增加，在結(jié)直腸癌中比例最高，隨著結(jié)直腸癌進(jìn)展，甲基化狀態(tài)改變越明顯。聯(lián)合檢測篩查結(jié)直腸癌可能會(huì)提高篩查的準(zhǔn)確性，可作為初步篩查結(jié)直腸癌的策略。綜上所述，SFRP2甲基化聯(lián)合定量免疫便潛血可以提高篩查結(jié)直腸癌準(zhǔn)確性，可作為社區(qū)篩查結(jié)直腸癌常規(guī)手段，值得臨床推廣應(yīng)用。