三苯基錫和聚苯乙烯微塑料聯(lián)合暴露對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性效應(yīng)

張瀟峮，王 偉，羅鳴鐘，柴 毅，沈子偉，倪朝輝

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223；2.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

三苯基錫(triphenyltin,TPT)是一類(lèi)重要的環(huán)境污染物[1,2]，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)方面，其使用量呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)。三苯基錫污染普遍存在我國(guó)水體環(huán)境中，東南沿海港口水域三苯基錫平均含量為0.7 mg/L[3]，青島石老人海水浴場(chǎng)的三苯基錫濃度更是高達(dá)53.2 ng/L[4]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，三峽水庫(kù)已經(jīng)受到三苯基錫污染物不同程度的影響[5]。

微塑料(Microplastics,MPs)是指直徑小于5 mm的塑料顆粒[6]。環(huán)境中的塑料垃圾或仍在使用的大塊塑料，在物理磨損、化學(xué)降解和生物降解的共同作用下降解為粒徑更小的塑料，逐漸形成微塑料[7,8]。微塑料性質(zhì)穩(wěn)定，進(jìn)入環(huán)境后難以被降解，可在風(fēng)力、河流、洋流等外力作用下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間、長(zhǎng)距離的遷移[9]，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成持久的影響，已成為當(dāng)前重要的全球性環(huán)境問(wèn)題。微塑料對(duì)于海洋環(huán)境的污染已早有研究[10]，而近年來(lái)在淡水水域也發(fā)現(xiàn)了不同程度的微塑料污染，其中包括我國(guó)的長(zhǎng)江流域及三峽水庫(kù)庫(kù)區(qū)[11]等。由于微塑料具有疏水性強(qiáng)、比表面積大的特點(diǎn)，已有許多研究表明微塑料可吸附水體中其他污染物，形成復(fù)合污染，這也導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)源對(duì)水生生物的污染脅迫途徑愈發(fā)復(fù)雜，會(huì)造成不可預(yù)知的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[12,13]。目前，有關(guān)微塑料與水環(huán)境中其他污染物復(fù)合污染的研究剛剛起步，且多集中于多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、多溴代二苯醚等傳統(tǒng)有機(jī)污染物[14-16]，有關(guān)微塑料與其他新興水體污染物之間的相互作用研究十分有限。

胭脂魚(yú)(Myxocryprinusasiaticus)屬于鯉形目(Cypiniformes)胭脂魚(yú)科(Catostomida)胭脂魚(yú)屬(Myxocyprimus)，本屬在我國(guó)僅胭脂魚(yú)1種，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江的干支流和附屬湖泊以及閩江流域[17]。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈及產(chǎn)卵場(chǎng)、棲息地生境退化，胭脂魚(yú)資源量已明顯下降。目前閩江的胭脂魚(yú)種群幾近絕跡，而長(zhǎng)江中的胭脂魚(yú)分布區(qū)也在逐漸縮小[18]。胭脂魚(yú)現(xiàn)已被列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)動(dòng)物[19]。為保護(hù)這一物種，采取了建立保護(hù)區(qū)、禁捕、增殖放流等保護(hù)手段[20]，三峽水庫(kù)庫(kù)區(qū)即為胭脂魚(yú)幼魚(yú)的重要放流區(qū)域。目前已有研究對(duì)胭脂魚(yú)的基礎(chǔ)生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)[21-23]，以及以農(nóng)藥和殺菌劑等為目標(biāo)污染物的環(huán)境毒理學(xué)進(jìn)行了探討[24]。尚未有關(guān)于胭脂魚(yú)在有機(jī)污染物和微塑料水體暴露下的生理毒理學(xué)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了胭脂魚(yú)對(duì)三苯基錫與微塑料聯(lián)合暴露的急性毒性效應(yīng)，旨在探討水環(huán)境中三苯基錫和微塑料對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的影響，為胭脂魚(yú)的資源保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胭脂魚(yú)由石首市長(zhǎng)吻鮠國(guó)家級(jí)良種場(chǎng)提供，挑選外觀正常，體質(zhì)健康，規(guī)格接近的個(gè)體 [體質(zhì)量(0.325±0.065)g，體長(zhǎng)(2.7±0.1)cm]用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室塑料箱中，用水為曝氣的自來(lái)水，氣泵連續(xù)充氣，溫度為(24.0±1.5)℃，溶氧≥6.0 mg/L，光照周期12 h光照 ∶12 h黑暗。

1.2 暴露液的配制

三苯基錫儲(chǔ)備液：取0.1 g三苯基錫(aladdin industrial corporation)溶于100 mL二甲基亞砜(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)中，配制成1 g/L的三苯基錫儲(chǔ)備液，避光4 ℃保存。

三苯基錫標(biāo)準(zhǔn)中間使用液：移取1 g/L的三苯基錫儲(chǔ)備液1 mL,用蒸餾水定容至1 000 mL，此三苯基錫標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度為1 mg/L。

微塑料溶液：聚苯乙烯(polystyrene,PS)微球(無(wú)錫瑞格生物科技有限責(zé)任公司)粒徑為(200±20)nm，密度為1.05 g/cm3，變異系數(shù)(CV)<6%，乙醇中溶脹率為5%～10%，微球電鏡形貌如圖1所示。實(shí)驗(yàn)前用純水稀釋到所需濃度。

圖1 聚苯乙烯微球形貌表征Fig.1 Morphology characterization of polystyrene microspheres

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察在48 h內(nèi)的情況，得出胭脂魚(yú)的最大無(wú)死亡質(zhì)量濃度和全部致死濃度。依照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的藥品濃度梯度。

1.3.1 三苯基錫急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間不投餌，為保證實(shí)驗(yàn)藥液質(zhì)量濃度，每隔24 h更換藥液1次。實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)方式水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法[25]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果按等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)6個(gè)濃度梯度(表1)。每濃度組10尾胭脂魚(yú)幼魚(yú)，設(shè)3個(gè)平行組，1個(gè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后12 h連續(xù)觀察胭脂魚(yú)幼魚(yú)的反應(yīng)及運(yùn)動(dòng)情況并記錄，在24、48、72、96 h觀察死亡數(shù)據(jù)并及時(shí)清出死亡個(gè)體。空白對(duì)照組有魚(yú)死亡，換魚(yú)重新馴養(yǎng)試驗(yàn)。

表1 三苯基錫的濃度梯度

1.3.2 三苯基錫和聚苯乙烯聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

在LC50實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別挑選高濃度組三苯基錫(0.126 mg/L)和低濃度組三苯基錫(0.032 mg/L)與聚苯乙烯微球溶液(0.1、1、10 mg/L)聯(lián)合對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的96 h急性毒性作用。每個(gè)濃度組設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)系列設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用寇式法(Karber)計(jì)算半致死濃度(LC50)、安全濃度(SC)和半致死濃度的95%置信區(qū)間(CI)，并做實(shí)驗(yàn)濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)與死亡率為縱坐標(biāo)的直線回歸方程，利用藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC)來(lái)分析胭脂魚(yú)體內(nèi)對(duì)藥物的蓄積、降減變化。采用T檢測(cè)比較，三苯基錫與三苯基錫+聚苯乙烯處理下胭脂魚(yú)存活情況是否存在差異，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，P<0.01時(shí)差異極顯著。相關(guān)計(jì)算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2

95%CI=LogLC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

MAC=100% ×(t1LC50-t2LC50)/(t0LC50-tmLC50)

上式中：Xm為消毒劑最大濃度的對(duì)數(shù)，d為相鄰濃度的對(duì)數(shù)差值，p為死亡率(%)，∑p為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組實(shí)驗(yàn)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的尾數(shù)；t1LC50和t2LC50為觀察時(shí)段t1和t2的半致死濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為實(shí)驗(yàn)初始、結(jié)束時(shí)半致死濃度(mg/L)。

2 結(jié)果

2.1 中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始6 h，三苯基錫高濃度組(濃度Ⅴ和Ⅵ)的胭脂魚(yú)幼魚(yú)開(kāi)始興奮，游動(dòng)迅速，上下攪動(dòng)水體，趨邊游動(dòng)或沖撞塑料箱沿壁。中低濃度組(濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)的胭脂魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，如浮頭、靜止不動(dòng)、呼吸不暢等癥狀，但過(guò)一段時(shí)間后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。6 h后高濃度組的胭脂魚(yú)幼魚(yú)身體逐漸地失去平衡，漂浮于水面，呼吸逐漸減弱，身體扭曲，翻轉(zhuǎn)，游動(dòng)緩慢，有部分側(cè)翻，最后沉底死亡。

2.2 三苯基錫的急性致死效應(yīng)

如表2所示，在96 h的急性毒性實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組的胭脂魚(yú)幼魚(yú)均未發(fā)生死亡，三苯基錫處理組胭脂魚(yú)幼魚(yú)的死亡率均隨藥物濃度增加，實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而上升。低濃度組(濃度Ⅰ)的三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的急性致死效應(yīng)最小，96 h的死亡率不超過(guò)10%；中高濃度組(濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的急性致死效應(yīng)較大，96 h各組均存在100%的死亡率。

表2 胭脂魚(yú)幼魚(yú)在三苯基錫作用下的死亡率

2.3 半致死濃度和毒性蓄積效應(yīng)

根據(jù)公式計(jì)算出三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的24、48、72和96 h的LC50、95%CI、MAC和SC(表3)。LC50均隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為0.112、0.053、0.026、0.017 mg/L，SC為0.003 mg/L，三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的MAC隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而下降，且下降較快。

表3 三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的半致死濃度、藥物毒性蓄積程度系數(shù)和安全濃度

2.4 三苯基錫與聚苯乙烯聯(lián)合的毒性效應(yīng)

T檢測(cè)結(jié)果表明，與聚苯乙烯聯(lián)合暴露對(duì)三苯基錫的毒性影響顯著，并且聚苯乙烯質(zhì)量濃度和暴露時(shí)間兩者間存在顯著的交互作用。由圖2可知，在三苯基錫低濃度組，聯(lián)合暴露于0.1 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚(yú)幼魚(yú)，72 h后的死亡率明顯低于其他處理組。由圖3可知，在三苯基錫高濃度組，聯(lián)合暴露于1 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚(yú)幼魚(yú)，24 h的死亡率明顯低于其他處理組；聯(lián)合暴露于1 mg/L及10 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚(yú)幼魚(yú)，48 h的死亡率明顯低于其他處理組，且在72 h的死亡率均未達(dá)到100%。表明聚苯乙烯對(duì)三苯基錫的毒性效應(yīng)具有延緩作用。

圖2 低濃度三苯基錫與聚苯乙烯聯(lián)合的急性毒性比較

圖3 高濃度三苯基錫與聚苯乙烯聯(lián)合的急性毒性比較Fig.3 Comparison of joint acute toxicity of high concentration TPT and PS on juvenile M.asiaticus

3 討論

3.1 三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的急性毒性特征

LC50是評(píng)價(jià)污染物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物急性毒性的重要指標(biāo)，根據(jù)國(guó)家環(huán)?？偩职l(fā)布的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，急性毒性96 hLC50<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。已有研究多集中于三苯基錫對(duì)于水層中底部水生生物的毒性影響，如羽搖蚊幼蟲(chóng)、小錐實(shí)螺、顫蚓[26]和海膽[27]等，結(jié)果表明三苯基錫毒性較大。宋志慧等[28]研究發(fā)現(xiàn),三苯基錫對(duì)斑馬魚(yú)的96 hLC50為0.012 mg/L，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三苯基錫對(duì)胭脂魚(yú)幼魚(yú)的96 hLC50為0.017 mg/L，可見(jiàn)三苯基錫對(duì)魚(yú)類(lèi)是劇毒物質(zhì)，三苯基錫污染會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生巨大的傷害。

3.2 三苯基錫在胭脂魚(yú)幼魚(yú)體內(nèi)的蓄積與降減的特征分析

在研究生物對(duì)毒物的蓄積與降減動(dòng)態(tài)時(shí)，常用MAC作為生物對(duì)毒物敏感程度差異的指示參數(shù)[29]。一般認(rèn)為，MAC為正值時(shí)，蓄積作用強(qiáng)于降減作用，MAC為負(fù)值時(shí)，降減作用強(qiáng)于蓄積作用；MAC值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大。王志錚等[30]研究三唑磷對(duì)彩虹明櫻蛤(Moerellairdescens)的急性毒性發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)時(shí)段的MAC值均大于零，表明蓄積過(guò)程在本次實(shí)驗(yàn)中一直占據(jù)主導(dǎo)地位， 48～72 hMAC值最高，也是彩虹明櫻蛤死亡高峰出現(xiàn)時(shí)段；王志錚等[31]研究魚(yú)安對(duì)麥瑞加拉鯪魚(yú)(Cirrhinamrigola)幼魚(yú)的急性毒性發(fā)現(xiàn)，魚(yú)安MAC值在2～4 h時(shí)段最小為-51.436%,表現(xiàn)為較為顯著的毒物降減情形,在4～6 h時(shí)段達(dá)到最大，表現(xiàn)為較為顯著的毒物蓄積情形，6～8 h時(shí)段蓄積幅度趨于緩和，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)4 h內(nèi)為魚(yú)安在魚(yú)體內(nèi)逐漸降減時(shí)段，之后魚(yú)體對(duì)魚(yú)安的蓄積趨于強(qiáng)勢(shì)，其中4～6 h時(shí)段為死亡高峰段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較三苯基錫48、72 、96 h的MAC值，發(fā)現(xiàn)MAC的值呈明顯下降趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)48～72 h胭脂魚(yú)幼魚(yú)對(duì)三苯基錫的MAC值下降明顯，三苯基錫實(shí)驗(yàn)48～72 h的MAC值是24～48 h的43.83%；在實(shí)驗(yàn)72～96 h胭脂魚(yú)幼魚(yú)對(duì)三苯基錫的MAC值下降明顯，三苯基錫實(shí)驗(yàn)72～96 h的MAC值是48～72 h的34.09%，說(shuō)明其降解毒效能力增強(qiáng)，毒效蓄積速度下降，表明胭脂魚(yú)幼魚(yú)對(duì)三苯基錫敏感性較強(qiáng)，其降解毒效能力較弱。因此在探討污染物對(duì)生物的毒性效應(yīng)時(shí)，應(yīng)分析污染物毒性蓄積變化，充分考慮時(shí)效性才能更全面評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)。

3.3 微塑料對(duì)三苯基錫毒性效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

本實(shí)驗(yàn)研究了三苯基錫與聚苯乙烯微球單獨(dú)聯(lián)合的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，高濃度聚苯乙烯微球與三苯基錫聯(lián)合暴露，可有效延緩三苯基錫的致死時(shí)間，暴露于三苯基錫高濃度組(0.126 mg/L)的胭脂魚(yú)幼魚(yú)，單獨(dú)或與聚苯乙烯結(jié)合，2 h后觀察到異常游泳，在其他低濃度處理組中都沒(méi)有觀察到此效應(yīng)。已有研究表明，微塑料可經(jīng)消化系統(tǒng)被水生生物吸收，而微塑料對(duì)魚(yú)體中的有機(jī)污染物具有較強(qiáng)吸附聚集作用，這可能是聚苯乙烯微球有效延緩三苯基錫致死時(shí)間的原因之一。乙酰膽堿酯酶(AchE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。Oliveira等[32]研究表明，微塑料對(duì)鰕虎魚(yú)幼魚(yú)AchE分泌具有明顯抑制作用，與本實(shí)驗(yàn)三苯基錫低濃度處理組與聚苯乙烯微球單獨(dú)或聯(lián)合暴露中，未觀察到胭脂魚(yú)幼魚(yú)異常游泳的結(jié)果一致。而聚苯乙烯微球延緩效果隨三苯基錫濃度升高而降低，高濃度組2 h后仍可觀察到異常游泳等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微塑料對(duì)三苯基錫毒性效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用存在濃度閾值，而具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。