長江上游中華紋胸鮡遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究

張力文，田輝伍，陳大慶，劉紹平，段辛斌，汪登強(qiáng)

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223)

紋胸鮡屬(Glyptothorax)起源于喜馬拉雅山及橫斷山脈中段，隨著喜馬拉雅山運(yùn)動，沿著江河向各處擴(kuò)散和遷移[1]，是鮡科魚類中種類最多、分布最廣的一個(gè)屬。根據(jù)《中國動物志》和《四川魚類志》的記錄，在我國境內(nèi)分布的紋胸鮡屬共有22種[2]，主要分布在伊洛瓦底江、怒江、瀾滄江、雅魯藏布江、元江和長江及其附屬水系。中華紋胸鮡(Glyptothoraxsinensis)和福建紋胸鮡(G.fukiensis)是該屬分布在低海拔的魚類，主要分布在長江及以南河流。謝仲桂等[3]和王汨等[4]從形態(tài)特征角度對這兩種魚進(jìn)行對比后，認(rèn)為二者并沒有明顯的性狀分化，應(yīng)為同種異名，因此，本研究將這兩種魚類統(tǒng)稱為中華紋胸鮡。

中華紋胸鮡為小型底棲魚類，喜棲息于流水環(huán)境中，產(chǎn)粘性卵，受精卵粘附在石頭上發(fā)育孵化。中華紋胸鮡分布較為廣泛，棲息在多種類型生態(tài)環(huán)境，既可生活在長江上游高山峽谷河流中，也可在長江中下游平原湖泊及河流中，形成了不同的生態(tài)群[5]，是研究生物地理學(xué)和環(huán)境適應(yīng)性的良好對象。長江上游漁業(yè)資源調(diào)查顯示，中華紋胸鮡是上游干支流主要漁獲物之一[6，11，12]。目前長江上游建設(shè)或規(guī)劃101座水電站[7]，導(dǎo)致中華紋胸鮡等魚類棲息地縮小和破碎化，阻礙其基因交流，引起資源量下降[8]。研究中華紋胸鮡群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，對評估水電開發(fā)對魚類的影響和制定資源保護(hù)措施具有重要意義。

目前有關(guān)中華紋胸鮡的研究主要集中在物種分類[9]、資源分布[10]和系統(tǒng)發(fā)育[11，20]方面，未見群體遺傳學(xué)研究報(bào)道。本研究采用Cytb和COI基因?qū)﹂L江上游中華紋胸鮡群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在闡明其遺傳背景、不同地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)，為資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采集于2017年至2018年，共9個(gè)采樣點(diǎn)341尾樣本。采樣點(diǎn)包括長江上游干流5個(gè)[巴南(BN)、江津(JJ)、合江(HJ)、瀘州(LZ)、南溪(NX)]、岷江1個(gè)[犍為(QW)]、金沙江中游1個(gè)[攀枝花(PZH)]、金沙江下游1個(gè)[巧家(QJ)]及金沙江支流黑水河1個(gè)[寧南(NN)]。采樣點(diǎn)和樣本量信息見圖1和表1。樣本經(jīng)鑒定[5]后剪取少量鰭條，保存于無水乙醇中備用。

圖1 中華紋胸鮡采樣位點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of G.sinensis

1.2 基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測序

樣本經(jīng)雙蒸水沖洗后浸泡2 h以上除去乙醇，采用鹽析法提取基因組DNA[12]。用線粒體DNACytb和COI基因序列進(jìn)行分析，其中Cytb基因擴(kuò)增引物可參考文獻(xiàn)[13]，COI基因擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[14]。兩個(gè)基因采用相同的PCR體系和反應(yīng)程序，PCR擴(kuò)增體系為5 0 μL，含2×Master Mix酶(武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴(kuò)增效果良好的擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用DNASTAR軟件包中的SeqMan對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，序列比對由CLUSTL X完成。使用MEGA v6.06[15]將序列進(jìn)行翻譯，以檢查是否存在測序錯(cuò)誤，并計(jì)算堿基組成和轉(zhuǎn)換/顛換比。群體遺傳多樣性參數(shù)，如變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)量、單倍型(Hd)和核苷酸(Pi)多樣性使用軟件Dnasp version 5.10[16]分析。應(yīng)用Arlequin version 3.1.1[17]進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)估算群體間遺傳變異及遺傳分化指數(shù)(FST)，分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。群體間基因流用公式計(jì)算。為了檢驗(yàn)群體間地理距離與遺傳分化是否符合距離隔離(Isolation by distance，IBD)[18]模式，用SPSS 22.0計(jì)算距離和遺傳分化指數(shù)的相關(guān)性。

單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)用NETWORK 5.0[19]完成。采用MEGA 6.0構(gòu)建基于Kimura-two-Parameter(K2P)單倍型鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)，boostrap設(shè)為1000，檢驗(yàn)分支支持率。為了確定本研究所采集樣本中是否存在隱存種或亞種，采用目前常被用作物種鑒定的DNA條形碼的COI基因進(jìn)行Automated barcode gap detection(ABGD)分析，由在線軟件服務(wù)器ABGD web(https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)完成，以P=0.01作為種數(shù)參考指數(shù)[20]。采用Structure 2.3.4 軟件分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，設(shè)置運(yùn)行參數(shù)K=2-9，每個(gè)K值10次重復(fù)，將運(yùn)算結(jié)果提交到在線工具Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)[21]計(jì)算△K，以△K的峰值，判斷群體的最佳K值。

為評估群體歷史動態(tài)，首先用Dnasp完成中性檢驗(yàn)(Tajima′s D,Fu′s Fs)和堿基錯(cuò)配分析。其次用BEAST version 2.4.3[22]進(jìn)行Bayesian skyline plot(BSP)分析，推斷中華紋胸鮡的群體動態(tài)。以上三種方式僅使用Cytb序列，BSP分析采用魚類線粒體Cytb的平均突變率(0.65%每百萬年)[23]，保證ESS值大于200，結(jié)果的圖形化用軟件Tracer version 1.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

序列對比后得到341條長度為1 057 bp的Cytb序列和109條長度為607 bp的COI序列。序列中的轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)，Ts/Tv比分別為6.328和14.331。Cytb序列和COI序列A+T含量分別為58.02%和54.3%，高于C+G含量(41.95%和45.7%)，與硬骨魚類一致[24]。

Cytb序列共檢測到80個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)52個(gè)，單一變異位點(diǎn)28個(gè)。341條序列定義了65個(gè)單倍型，其中單倍型HB_2頻率最高，為35.78%，其次是HB_19為12.32%，HB_9為8.21%。其中單倍型HB_2和HB_9為長江干流和岷江6個(gè)群體共享。HB_19為QJ和NN 2個(gè)群體共享。總樣本Hd和Pi分別為0.845和0.007(表1)。各群體中，BN群體Hd最高為0.867，PZH群體Pi最高為0.005，NN群體最低，分別為0.251和0.002。

COI序列共檢測到31個(gè)變異位點(diǎn)，其中13個(gè)簡約信息位點(diǎn)，18個(gè)單一變異位點(diǎn)。109條序列共定義了23個(gè)單倍型，其中單倍型HC_1和HC_4頻率最高，分別為38.53%和25.69%，為LZ、NX和QW群體共享。單倍型HC_7頻率為9.17%，僅出現(xiàn)在NN群體?？倶颖綡d和Pi分別為0.774和0.005(表1)。兩種標(biāo)記得到的遺傳多樣性指數(shù)相近，金沙江的3個(gè)群體遺傳多樣性低于長江上游群體。

表1 中華紋胸鮡線粒體DNA群體遺傳多樣性和中性檢驗(yàn)Tab.1 Genetic diversity parameters and neutral test of G.sinensis populations based on mtDNA

2.1.2 遺傳結(jié)構(gòu)

分子變異方差分析(AMOVA)顯示，無論是Cytb序列還是COI序列，遺傳變異主要來自群體間(Cytb，59.62%；COI，55.24%)，群體間出現(xiàn)顯著遺傳分化(Cytb，F(xiàn)ST=0.60，P<0.01；COI，F(xiàn)ST=0.55，P<0.01)(表2)。

基于Cytb序列的兩兩群體間FST分析結(jié)果見表3，長江干流5個(gè)群體和岷江的犍為群體間FST均小于0.05，這6個(gè)群體與QJ、NN和PZH群體之間的FST都大于0.7。QJ和NN群體間FST也小于0.05，它們與PZH群體間的FST為0.459和0.644?；蛄鞣治鲲@示長江干流和岷江群體間Nm值(或絕對值)均大于8，它們與QJ、NN和PZH群體間對群體間FST(表3)與地理距離(表4)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析表明，這兩個(gè)變量間呈線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.696，P<0.001)。

表3 基于Cyt b的中華紋胸鮡群體間兩兩FST(對角線下方)和基因流 Nm(對角線上方)Tab.3 Pairwise FST(below diagonal)and Nm values(above diagonal)among populations of G.sinensis based on Cyt b sequences

表4 中華紋胸鮡群體間的地理距離Tab.4 Pairwise geographical distances among G.sinensis populations km

利用Median Joining方法構(gòu)建Cytb單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(圖2)顯示，中華紋胸鮡群體形成三個(gè)明顯分支：Clade I、Clade II和Clade III，分支間突變步驟為12-22個(gè)，分支內(nèi)相鄰單倍型間突變步驟最多為5個(gè)(圖2 a)。Clade I個(gè)體主要來自于BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW等群體；Clade II主要來自NN和QJ等群體；Clade III主要來自PZH等群體(圖2 a)。COI單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖形成兩個(gè)分支：Clade A、Clade B，Clade A主要來自LZ、NX、QW等群體，與Cytb的Clade I對應(yīng)；Clade B主要來自寧南等群體，與Cytb的Clade II對應(yīng)(圖2 b)。

以老撾紋胸鮡(G.laosensis)和扎那紋胸鮡(G.zanaensis)(登錄號：HM636516.1,HM636515.1，HQ898002.1,HQ593565.1,DQ514349.1,KM610 755.1)為外類群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中Cytb系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)三個(gè)具有高支持率的分支，COI樹有兩個(gè)高支持率分支，分別與單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖的分支對應(yīng)?；谶z傳距離的ABGD分析結(jié)果表明，P=0.01時(shí)，樣本被劃分為一組。

對全部樣本進(jìn)行Structure聚類分析，根據(jù)△K結(jié)果顯示K=2時(shí)最佳。當(dāng)K=2時(shí)，長江上游6個(gè)群體和金沙江3個(gè)群體被分為2個(gè)不同群體(圖3a)；當(dāng)K=3或4時(shí)(圖3 b、c)，樣本被劃分為3個(gè)聚類群，長江上游、QJ和NN、PZH群體各為一個(gè)聚類群，與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(圖2)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)相符合。

圖3 基于Cyt b序列的中華紋胸鮡群體Structure聚類分析Fig.3 Structure clustering conducted based on Cyt b within populations of G.sinensis

圖2 基于Cyt b序列(a)和COI序列(b)構(gòu)建的中華紋胸鮡單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(右)和鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(左)Fig.2 Haplotype network(right)and NJ phylogenetic tree(left)of G.sinensis based on(a)Cyt b and(b)COI sequences單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖中一個(gè)圓圈代表一個(gè)單倍型，圓圈大小代表樣本頻率.

2.1.3 種群歷史

對Cytb序列的9個(gè)群體以及Clade I、II(圖4)分別進(jìn)行Tajima′s D[25]和Fu′s Fs[26]中性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Clade I(-59.18，-2.18)均為顯著負(fù)值，長江上游群體也均為負(fù)值(表1)。堿基錯(cuò)配分析顯示，Clade I、Clade II呈多峰結(jié)構(gòu)(圖4)。BSP分析結(jié)果表明，Clade I群體在距今0.1～0.04 Ma(百萬年)經(jīng)歷了擴(kuò)張事件。

圖4 基于Cyt b序列的中華紋胸鮡錯(cuò)配分布分析和BSP分析Fig.4 Graphs of mismatch distribution and extended BSP for G.sinensis based on Cyt b

3 討論

3.1 遺傳多樣性

目前已開展群體遺傳學(xué)研究的紋胸鮡屬魚類有怒江扎那紋胸鮡(Hd=0.851,Pi=0.014)[27]和瀾滄江老撾紋胸鮡(Hd=0.299,Pi=0.000 32)[24]，與這兩種魚比較，中華紋胸鮡總體遺傳多樣性(表1)與扎那紋胸鮡相似，高于老撾紋胸鮡。但從不同群體看，各群體遺傳多樣性差異較大，其中金沙江的3個(gè)群體(PZH、NN、QJ)遺傳多樣性明顯低于長江上游及岷江的6個(gè)群體(表1)。金沙江中華紋胸鮡群體低水平的遺傳多樣性可能是由于奠基者效應(yīng)造成。受第四紀(jì)冰期影響，冰期期間中華紋胸鮡可能僅存于長江中下游，隨著冰期結(jié)束，金沙江各江段氣候隨海拔從低到高逐漸回暖，中華紋胸鮡從長江中下游逐漸往上遷移而形成目前的格局。長江和金沙江的泉水魚(Semilabeoprochilus)[28]和裸體異鰾鰍鮀(Xenophysogobionudicorpa)[29]也有類似的情況。

3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析、network網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹以及Structure聚類分析的結(jié)果都表明，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體存在顯著遺傳分化，至少形成3個(gè)遺傳譜系，分別為金沙江中游(PZH)、金沙江下游(QJ、NN)、長江上游(BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW)群體。Pearson相關(guān)性分析顯示中華紋胸鮡群體間FST與地理距離呈正相關(guān)關(guān)系(r>0.6)，說明中華紋胸鮡群體的遺傳結(jié)構(gòu)是距離隔離造成，符合IBD模式。距離和生境的差異是中華紋胸鮡產(chǎn)生群體隔離的可能原因。中華紋胸鮡為底棲魚類，產(chǎn)粘性卵，活動范圍窄，本研究采樣點(diǎn)最大距離達(dá)540 km(表4)，攀枝花到重慶巴南江段海拔落差達(dá)920 m左右，金沙江段內(nèi)地形極為復(fù)雜，眾多高山深谷相間并列，流域內(nèi)氣候時(shí)空變化較大，垂直差異十分顯著。這些因素阻礙了中華紋胸鮡遷移，基因流分析結(jié)果也表明了三個(gè)譜系間幾乎沒有基因交流。

歷史研究表明中華紋胸鮡存在多個(gè)生態(tài)類群[5]，本研究結(jié)果顯示中華紋胸鮡存在多個(gè)遺傳譜系，為了揭示中華紋胸鮡是否存在隱存種或亞種，本研究用兩種方法進(jìn)行檢驗(yàn)，即遺傳距離和ABGD法。首先，根據(jù)李博[30]基于Cytb序列計(jì)算三種紋胸鮡屬魚類[中華紋胸鮡、扎那紋胸鮡、穴形紋胸鮡(G.cavia)]之間遺傳距離，種間遺傳距離在0.067～0.098之間；王利華等[31]基于Cytb序列計(jì)算的鲌屬6種魚類的種間遺傳距離在0.1～7.5。本研究中中華紋胸鮡9個(gè)群體間的遺傳距離在0.003～0.020，單倍型之間遺傳距離最大為0.027(HB_21-HB_61)，遠(yuǎn)小于鲌屬和紋胸鮡屬種間的遺傳距離。其次，通常用DNA條形碼ABGD作種類鑒定時(shí)，一般以P=0.01顯示組數(shù)作為種類數(shù)量的依據(jù)[20]。本研究COI基因的ABGD分析結(jié)果表明，所分析的樣本在P=0.01下只有一個(gè)組即為同一個(gè)種。綜合以上兩種方法結(jié)果表明，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體中并無隱存種或亞種存在。

本研究的采樣江段中建有兩座電站，即向家壩水電站和溪洛渡水電站，位于宜賓和巧家之間，AMOVA分析顯示水電站上游(BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW)、下游(QJ、NN、PZH)群體有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)差異(表2)，但這種差異是種群歷史造成，而不是大壩阻隔的影響。Sturcture分析顯示Clade I(主要是大壩下游群體)包含有大壩上游的少量個(gè)體，而Clade II和III完全沒有大壩下游個(gè)體(圖3)，目前大壩運(yùn)行距采樣時(shí)間僅5年，難以對群體差異產(chǎn)生如此大的影響。并且，攀枝花江段與巧家江段之間目前未受大壩阻隔，但兩群體間也發(fā)生了顯著遺傳分化，因此，大壩建設(shè)是否會對群體基因交流造成影響，有待今后長期監(jiān)測。

3.3 種群歷史

BSP分析表明，中華紋胸鮡長江上游群體(Clade I)在晚更新世(0.13～0.01 Ma)發(fā)生了種群擴(kuò)張事件，此時(shí)為末次冰期后期，長江上游氣候回暖，有利于中華紋胸鮡群體增長。長江上游一些特有魚類，如紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)、長薄鰍(L.elongata)[32]、裸體異鰾鰍鮀、異鰾鰍鮀(X.boulengeri)[29]等也在這一時(shí)期檢測到種群擴(kuò)張事件。金沙江下游群體(Clade II)在0～0.0125 Ma也檢測到擴(kuò)張現(xiàn)象(圖4)，擴(kuò)張時(shí)間比Clade I的要晚，說明金沙江出現(xiàn)適宜于中華紋胸鮡氣候的時(shí)間更晚，與其較高海拔相符。

本研究結(jié)果顯示，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體發(fā)生了顯著的遺傳分化，將金沙江中游、金沙江下游、長江上游群體分別視為一個(gè)進(jìn)化顯著單元(ESU)[33]，應(yīng)對三個(gè)單元分別加以保護(hù)。巧家、寧南、攀枝花江段中華紋胸鮡群體遺傳多樣性較低，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較低，在金沙江水電工程開發(fā)過程中需要特別加以關(guān)注。